GFHDT: 結合核形態測量與機器學習識別衰老的動態狀態
結合核形態測量與機器學習識別衰老的動態狀態
11 Jan 2026 at 02:17am
細胞衰老是一種不可逆的細胞週期停滯狀態，在組織修復、老化和疾病中具有複雜作用。 然而，由於識別細胞衰老的不一致性，對其功能意義的結論各不相同。 我們開發了一種基於機器學習的方法，通過核形態測量以單細胞解析度識別衰老細胞。 通過應用無監督聚類和降維技術，我們構建了一個強大的流程，用以區分培養系統、新鮮分離細胞群和組織切片中的衰老細胞。 本文展示了該方法揭示再生骨骼肌和骨關節炎軟骨中與年齡相關的衰老動態模式的能力。 我們的方法提供了一種廣泛適用的策略，可以在不同的生物學背景下繪製和量化衰老細胞狀態，從而評估這種細胞命運如何在生命週期內對組織重塑和退化產生影響。
氧化應激誘導成肌細胞培養中的衰老
為了研究與衰老相關的核表型變化，我們設計了一種體外培養系統，使用過氧化氫（H₂O₂）刺激氧化應激和損傷，以誘導成肌細胞系（C2C12）發生衰老（圖1A）。 該處理導致表達增殖標誌物Ki67的細胞減少、DNA損傷標誌物γH2AX的表達增加以及SA-β-gal活性的增強，並呈劑量依賴性（圖1B、C）。 缺乏Caspase-3染色證實這些細胞並未進入凋亡（圖1B）。 此外，即時定量PCR（qPCR）驗證了處理細胞中的衰老相關分泌表型（SASP）表達譜（圖1D）。 因此，我們建立了一種H₂O₂處理方案，能夠誘導真實的衰老狀態，從而為研究相關核形態變化提供了一個可靠的系統。
圖1：衰老轉化改變核形態
【A】展示了用於識別衰老的核形態測量流程（NMP）示意圖（由BioRender創建。 Mapkar， S. （2025） < – 平均螢光強度。 n = 3次獨立實驗重複。 【C】Spider SA-β-Gal染色的代表性FACS直方圖。 圖表量化了相對於未處理和未染色樣本的重複實驗。 藍色 – 未處理，紅色 – 300 μM，橙色 – 500 μM。 n = 3次獨立實驗重複。 【D】通過qRT-PCR評估SASP。 n = 4次獨立實驗重複，每列代表一次重複。 綠色 – 表達增加，橙色 – 表達減少，白色 – 與未處理組相當。 【E】不同處理組之間核形態的代表性圖像和量化結果。 注意，圖像查找表（LUTs）和曝光時間是一致的。 比例尺 – 50 μm。 n = 3次獨立實驗重複。 誤差條表示平均值 標準誤（SEM），統計測試使用未配對雙側t檢驗，且未進行調整。 *p ≤ 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。 源數據以源數據檔形式提供。 精確的p值列於補充表2。
核形態測量識別出真實的衰老細胞
我們進一步通過DAPI染色檢查了與H₂O₂處理相關的核表型，以提供更清晰的核定義。 隨著H₂O₂濃度的增加，我們檢測到核尺寸增大和緻密焦點增多，同時伴隨著核圓形度和DAPI強度的下降（圖1E和補充圖1），這些特徵各自都被獨立地認為與衰老相關。 參數對之間的相關強度也隨著H₂O₂濃度的增加而增強，表明衰老細胞共用許多這些核形態特徵（補充圖2A）。 為了識別那些共用所有參數並最能指示衰老的細胞，我們應用了一種k-means無監督機器學習演算法來劃分具有明確形態相似性的群體，並確定共用所有四個參數的衰老核（圖2A和補充圖2C）。 聚類是在包含所有四個參數的標準化特徵集上進行的，以保留每個形態特徵內部和之間的
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差異。 肘部圖和輪廓法被用來劃分聚類數量（補充圖2B）。 為了生成具有單細胞解析度的二維表示，我們使用均勻流形近似投影（UMAP）對這四個參數進行了降維（補充圖2C）。 進一步的降維產生了一個一維的“衰老評分”，以實現UMAP內核表型和處理條件之間的直接比較，從而確立了“衰老梯度”（圖2B和補充圖2D）。 通過k-means演算法識別的聚類，我們將具有極端形態學特徵的細胞標記為真正的衰老細胞。 另一類表現出較少極端表型但共用許多這些特徵的細胞則被標記為“類衰老”細胞（圖2C）。 在最高H₂O₂處理樣本中，被識別為衰老和類衰老細胞的比例最大（圖2C）。 處於聚類邊界的細胞很可能表示過渡狀態，因為它們預計會部分共用核表型特徵（圖2A、B和補充圖2C、D）。
圖2：核形態測量定義衰老並可簡化為統一評分
【A】通過k-means聚類演算法解析的五個組的單細胞核形態UMAP圖。 插圖為每個聚類的代表性核。 圖像查找表（LUTs）和曝光時間保持一致。 比例尺 – 5 μm。 【B】進一步降維形成的一維衰老“評分”，與核表型和處理條件相關聯。 【C】橙色（衰老）和紅色（類衰老）聚類表現出強烈的衰老表型，並在柱狀圖中量化。 n = 3次獨立實驗重複。 【D】NMP識別的聚類中衰老相關標誌物的量化。 MFI – 平均螢光強度; NS – 非衰老; SEN – 衰老。 n = 3次獨立實驗重複。 【E】代表性的UMAP圖和折線圖量化了隨著衰老溶解濃度增加SnCs的減少，如NMP所檢測到的。 灰色 – 未處理，藍色 – 300 μM，綠色 – 500 μM。 小提琴圖顯示了衰老評分（y軸），表明低分、形態上衰老的核密度下降，如紅框所示。 比較在處理組內進行。 n = 3次獨立實驗重複。 誤差條表示平均值 標準誤（SEM），統計測試使用未配對雙側t檢驗，未進行調整，僅（E）使用了雙向ANOVA。 *p ≤ 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。 源數據以源數據檔形式提供。 精確的p值列於補充表2。
為了確認由核形態測量流程（NMP）聚類的細胞確實是衰老細胞，我們評估了其細胞周期狀態（Ki67）、DNA損傷程度（γH2AX）和SA-β-gal活性（圖2D）。 NMP識別的衰老核顯示出Ki67染色減少、γH2AX平均螢光強度（MFI）增加以及SA-β-gal活性增強（圖2D和補充圖4A&ndash
），共同支援了衰老表型。 具體而言，非衰老聚類中不到3%的核為X-Gal陽性，衰老聚類中不到2%的核為Ki67陽性，而非衰老到衰老聚類中γH2AX表達增加了兩倍（圖2D）。 還檢查了每個非衰老聚類，顯示基因表達梯度與通向衰老的表型梯度一致（補充圖3A、B）。 此外，應用衰老溶解劑Navitoclax（ABT-263）處理后，結果顯示在最高H₂O₂處理樣本中，衰老聚類中的核數量呈劑量依賴性減少（圖2E）。
NMP捕獲來自各種誘導劑和細胞系的SnCs
為了檢查該流程在不同衰老誘導機制中的有效性，我們擴展了衰老誘導劑，包括依託泊苷和阿黴素作為H₂O₂的替代品（圖3和補充圖4）。 依託泊苷和阿黴素都作為拓撲異構酶II抑製劑，引起DNA損傷積累，從而引發DNA損傷反應（DDR）。 阿黴素還有增加氧化應激的作用。 因此，這兩種藥物在既定濃度下都是強有力的衰老誘導劑。 在用這些小分子處理C2C12細胞后，我們通過驗證細胞週期退出（Ki67+細胞減少）、DNA損傷增加（γH2AX染色增加）和SA-β-gal活性增加，證實了劑量回應性衰老誘導（圖3A、B）。 接下來，我們建立了與衰老表型一致的核形態變化，表現為核尺寸增大和緻密焦點增多，核圓形度和DAPI強度降低（圖3C、D）。 然後部署NMP評估經依託泊苷（圖3E和補充圖4E–H）或阿黴素（圖3F和補充圖4I–L）處理的核，生成UMAP以可視化降維后的核形態梯度。 標記為衰老的聚類表現出細胞週期退出（Ki67減少）、DNA損傷（γH2AX MFI增加）和溶酶體積累（SA-β-gal活性增加）的特徵，證明NMP可以有效識別來自不同機制的SnCs（圖3E、F）。
圖3：NMP適用於各種衰老誘導機制
【A】【B】C2C12細胞經（A）依託泊苷和（B）阿黴素處理后衰老標誌物的量化。 n = 3次獨立實驗重複。 【C】【D】經（C）依託泊苷 - Etop 和（D）阿黴素 - Dox 處理的C2C12細胞的代表性圖像和核形態量化。 注意每種小分子誘導劑的劑量回應。 曝光時間和查找表（LUTs）保持不變。 比例尺 – 200 μm。 n = 3次獨立實驗重複。 【E】【F】通過k-means聚類演算法解析的五個組的大UMAP圖，分別展示（E）依託泊苷和（F）阿黴素處理后單細胞核形態的降維結果。 插圖為每個聚類的代表性核。 比例尺 – 20 μm。 小UMAP圖中的一維衰老“評分”與核表型和處理條件相關聯，並在小提琴圖中呈現劑量依賴性量化。 橙色（衰老）和紅色（類衰老）聚類表現出強烈的衰老表型，並在水準彩色條形圖中量化。 n = 3次獨立實驗重複。 灰色條形圖是NMP識別為衰老的聚類中衰老相關標誌物的量化結果。 n = 3次獨立實驗重複。 MFI – 平均螢光強度。 NS – 非衰老; SEN – 衰老。 誤差條表示平均值 標準誤（SEM），統計測試使用未配對雙側t檢驗，未進行調整。 *p ≤ 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。 源數據以源數據檔形式提供。 精確的p值列於補充表2。
我們假設用於NMP的四個核形態測量值在經歷衰老的細胞類型中是保守的，從而賦予NMP廣泛的適用性。 為了驗證這一前提，我們用H₂O₂、依託泊苷和阿黴素處理了細胞系3T3-L1前脂肪細胞（補充圖5）。 選擇3T3-L1是
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因為先前研究表明脂肪組織對衰老有強烈反應，因而可能具有潛在的生物學意義。 所有處理均以劑量依賴方式確認了衰老誘導，SASP分析通過即時qPCR完成（補充圖5A），Ki67表達減少，γH2AX表達增加（補充圖3E、G和補充圖5B&ndash）。 需要注意的是，我們無法在衰老的3T3-L1細胞中獲得一致的SA-β-gal染色結果，強調了開發跨細胞類型識別SnCs新方法的重要性。 隨著H₂O₂（補充圖5E）、依託泊苷（補充圖5F）和阿黴素（補充圖5G）處理的增加，核形態變化與描述一致。 NMP聚類顯示，衰老樣和衰老核的數量呈劑量依賴性增加，得分相應減少（補充圖6A–C）。 通過NMP確認了這些聚類為衰老細胞，其單細胞解析度顯示Ki67表達減少和γH2AX表達增加，適用於H₂O₂（補充圖6D）、依託泊苷（補充圖6E）和阿黴素（補充圖6F）處理
氧化應激誘導成肌細胞培養中的衰老
為了研究與衰老相關的核表型變化，我們設計了一種體外培養系統，使用過氧化氫（H₂O₂）刺激氧化應激和損傷，以誘導成肌細胞系（C2C12）發生衰老（圖1A）。 該處理導致表達增殖標誌物Ki67的細胞減少、DNA損傷標誌物γH2AX的表達增加以及SA-β-gal活性的增強，並呈劑量依賴性（圖1B、C）。 缺乏Caspase-3染色證實這些細胞並未進入凋亡（圖1B）。 此外，即時定量PCR（qPCR）驗證了處理細胞中的衰老相關分泌表型（SASP）表達譜（圖1D）。 因此，我們建立了一種H₂O₂處理方案，能夠誘導真實的衰老狀態，從而為研究相關核形態變化提供了一個可靠的系統。
圖1：衰老轉化改變核形態
【A】展示了用於識別衰老的核形態測量流程（NMP）示意圖（由BioRender創建。 Mapkar， S. （2025） < – 平均螢光強度。 n = 3次獨立實驗重複。 【C】Spider SA-β-Gal染色的代表性FACS直方圖。 圖表量化了相對於未處理和未染色樣本的重複實驗。 藍色 – 未處理，紅色 – 300 μM，橙色 – 500 μM。 n = 3次獨立實驗重複。 【D】通過qRT-PCR評估SASP。 n = 4次獨立實驗重複，每列代表一次重複。 綠色 – 表達增加，橙色 – 表達減少，白色 – 與未處理組相當。 【E】不同處理組之間核形態的代表性圖像和量化結果。 注意，圖像查找表（LUTs）和曝光時間是一致的。 比例尺 – 50 μm。 n = 3次獨立實驗重複。 誤差條表示平均值 標準誤（SEM），統計測試使用未配對雙側t檢驗，且未進行調整。 *p ≤ 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。 源數據以源數據檔形式提供。 精確的p值列於補充表2。
核形態測量識別出真實的衰老細胞
我們進一步通過DAPI染色檢查了與H₂O₂處理相關的核表型，以提供更清晰的核定義。 隨著H₂O₂濃度的增加，我們檢測到核尺寸增大和緻密焦點增多，同時伴隨著核圓形度和DAPI強度的下降（圖1E和補充圖1），這些特徵各自都被獨立地認為與衰老相關。 參數對之間的相關強度也隨著H₂O₂濃度的增加而增強，表明衰老細胞共用許多這些核形態特徵（補充圖2A）。 為了識別那些共用所有參數並最能指示衰老的細胞，我們應用了一種k-means無監督機器學習演算法來劃分具有明確形態相似性的群體，並確定共用所有四個參數的衰老核（圖2A和補充圖2C）。 聚類是在包含所有四個參數的標準化特徵集上進行的，以保留每個形態特徵內部和之間的
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差異。 肘部圖和輪廓法被用來劃分聚類數量（補充圖2B）。 為了生成具有單細胞解析度的二維表示，我們使用均勻流形近似投影（UMAP）對這四個參數進行了降維（補充圖2C）。 進一步的降維產生了一個一維的“衰老評分”，以實現UMAP內核表型和處理條件之間的直接比較，從而確立了“衰老梯度”（圖2B和補充圖2D）。 通過k-means演算法識別的聚類，我們將具有極端形態學特徵的細胞標記為真正的衰老細胞。 另一類表現出較少極端表型但共用許多這些特徵的細胞則被標記為“類衰老”細胞（圖2C）。 在最高H₂O₂處理樣本中，被識別為衰老和類衰老細胞的比例最大（圖2C）。 處於聚類邊界的細胞很可能表示過渡狀態，因為它們預計會部分共用核表型特徵（圖2A、B和補充圖2C、D）。
圖2：核形態測量定義衰老並可簡化為統一評分
【A】通過k-means聚類演算法解析的五個組的單細胞核形態UMAP圖。 插圖為每個聚類的代表性核。 圖像查找表（LUTs）和曝光時間保持一致。 比例尺 – 5 μm。 【B】進一步降維形成的一維衰老“評分”，與核表型和處理條件相關聯。 【C】橙色（衰老）和紅色（類衰老）聚類表現出強烈的衰老表型，並在柱狀圖中量化。 n = 3次獨立實驗重複。 【D】NMP識別的聚類中衰老相關標誌物的量化。 MFI – 平均螢光強度; NS – 非衰老; SEN – 衰老。 n = 3次獨立實驗重複。 【E】代表性的UMAP圖和折線圖量化了隨著衰老溶解濃度增加SnCs的減少，如NMP所檢測到的。 灰色 – 未處理，藍色 – 300 μM，綠色 – 500 μM。 小提琴圖顯示了衰老評分（y軸），表明低分、形態上衰老的核密度下降，如紅框所示。 比較在處理組內進行。 n = 3次獨立實驗重複。 誤差條表示平均值 標準誤（SEM），統計測試使用未配對雙側t檢驗，未進行調整，僅（E）使用了雙向ANOVA。 *p ≤ 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。 源數據以源數據檔形式提供。 精確的p值列於補充表2。
為了確認由核形態測量流程（NMP）聚類的細胞確實是衰老細胞，我們評估了其細胞周期狀態（Ki67）、DNA損傷程度（γH2AX）和SA-β-gal活性（圖2D）。 NMP識別的衰老核顯示出Ki67染色減少、γH2AX平均螢光強度（MFI）增加以及SA-β-gal活性增強（圖2D和補充圖4A&ndash
），共同支援了衰老表型。 具體而言，非衰老聚類中不到3%的核為X-Gal陽性，衰老聚類中不到2%的核為Ki67陽性，而非衰老到衰老聚類中γH2AX表達增加了兩倍（圖2D）。 還檢查了每個非衰老聚類，顯示基因表達梯度與通向衰老的表型梯度一致（補充圖3A、B）。 此外，應用衰老溶解劑Navitoclax（ABT-263）處理后，結果顯示在最高H₂O₂處理樣本中，衰老聚類中的核數量呈劑量依賴性減少（圖2E）。NMP捕獲來自各種誘導劑和細胞系的SnCs
為了檢查該流程在不同衰老誘導機制中的有效性，我們擴展了衰老誘導劑，包括依託泊苷和阿黴素作為H₂O₂的替代品（圖3和補充圖4）。 依託泊苷和阿黴素都作為拓撲異構酶II抑製劑，引起DNA損傷積累，從而引發DNA損傷反應（DDR）。 阿黴素還有增加氧化應激的作用。 因此，這兩種藥物在既定濃度下都是強有力的衰老誘導劑。 在用這些小分子處理C2C12細胞后，我們通過驗證細胞週期退出（Ki67+細胞減少）、DNA損傷增加（γH2AX染色增加）和SA-β-gal活性增加，證實了劑量回應性衰老誘導（圖3A、B）。 接下來，我們建立了與衰老表型一致的核形態變化，表現為核尺寸增大和緻密焦點增多，核圓形度和DAPI強度降低（圖3C、D）。 然後部署NMP評估經依託泊苷（圖3E和補充圖4E–H）或阿黴素（圖3F和補充圖4I–L）處理的核，生成UMAP以可視化降維后的核形態梯度。 標記為衰老的聚類表現出細胞週期退出（Ki67減少）、DNA損傷（γH2AX MFI增加）和溶酶體積累（SA-β-gal活性增加）的特徵，證明NMP可以有效識別來自不同機制的SnCs（圖3E、F）。
圖3：NMP適用於各種衰老誘導機制
【A】【B】C2C12細胞經（A）依託泊苷和（B）阿黴素處理后衰老標誌物的量化。 n = 3次獨立實驗重複。 【C】【D】經（C）依託泊苷 - Etop 和（D）阿黴素 - Dox 處理的C2C12細胞的代表性圖像和核形態量化。 注意每種小分子誘導劑的劑量回應。 曝光時間和查找表（LUTs）保持不變。 比例尺 – 200 μm。 n = 3次獨立實驗重複。 【E】【F】通過k-means聚類演算法解析的五個組的大UMAP圖，分別展示（E）依託泊苷和（F）阿黴素處理后單細胞核形態的降維結果。 插圖為每個聚類的代表性核。 比例尺 – 20 μm。 小UMAP圖中的一維衰老“評分”與核表型和處理條件相關聯，並在小提琴圖中呈現劑量依賴性量化。 橙色（衰老）和紅色（類衰老）聚類表現出強烈的衰老表型，並在水準彩色條形圖中量化。 n = 3次獨立實驗重複。 灰色條形圖是NMP識別為衰老的聚類中衰老相關標誌物的量化結果。 n = 3次獨立實驗重複。 MFI – 平均螢光強度。 NS – 非衰老; SEN – 衰老。 誤差條表示平均值 標準誤（SEM），統計測試使用未配對雙側t檢驗，未進行調整。 *p ≤ 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。 源數據以源數據檔形式提供。 精確的p值列於補充表2。
我們假設用於NMP的四個核形態測量值在經歷衰老的細胞類型中是保守的，從而賦予NMP廣泛的適用性。 為了驗證這一前提，我們用H₂O₂、依託泊苷和阿黴素處理了細胞系3T3-L1前脂肪細胞（補充圖5）。 選擇3T3-L1是
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）。 需要注意的是，我們無法在衰老的3T3-L1細胞中獲得一致的SA-β-gal染色結果，強調了開發跨細胞類型識別SnCs新方法的重要性。 隨著H₂O₂（補充圖5E）、依託泊苷（補充圖5F）和阿黴素（補充圖5G）處理的增加，核形態變化與描述一致。 NMP聚類顯示，衰老樣和衰老核的數量呈劑量依賴性增加，得分相應減少（補充圖6A–C）。 通過NMP確認了這些聚類為衰老細胞，其單細胞解析度顯示Ki67表達減少和γH2AX表達增加，適用於H₂O₂（補充圖6D）、依託泊苷（補充圖6E）和阿黴素（補充圖6F）處理
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