GFHDT: 轉錄錯誤在人類細胞中產生類澱粉樣蛋白
轉錄錯誤在人類細胞中產生類澱粉樣蛋白
27 Jan 2026 at 04:48am
老化的特徵是出現具有類澱粉樣行為的蛋白質積累。 然而，這些蛋白質產生的分子機制尚不清楚。 在此，我們證明在包括幹細胞、腦類器官和完全分化的神經元等多種人類細胞類型中，信使 RNA 分子中的錯誤會產生類澱粉樣蛋白。 其中一些錯誤會產生已知可導致疾病的突變蛋白，而另一些則產生以前未觀察到的蛋白質。 此外，我們表明當細胞暴露於DNA損傷時，這些錯誤會增加，這是人類衰老的一個主要標誌。 綜合來看，這些實驗表明瞭正常衰老過程與年齡相關疾病之間存在機制聯繫。
儘管長期以來一直懷疑轉錄錯誤在這些結構的形成中起作用，但由於與錯誤檢測相關的技術限制，很難驗證這一假設。 為解決此問題，我們最近優化了一種稱為圓環測序的 RNA 測序工具，它能夠對 mRNA 分子進行高保真測序。 在此，我們使用圓環測序證明轉錄錯誤在人類細胞中普遍存在，並且確實導致具有類澱粉樣和朊病毒樣特性的蛋白質。 我們通過各種細胞、生化和生物物理實驗支援了這些觀察結果，這些實驗表明這些錯誤產生的蛋白質能夠成功地將野生型蛋白質轉化為類澱粉樣狀態，然後自我組裝成具有各種結構的蛋白質聚集體。 最後，我們表明由於DNA損傷，導致啟動大規模蛋白質聚集所需的突變蛋白數量通常會超過閾值，這是衰老細胞的普遍標誌。 因此，我們的實驗在DNA損傷和蛋白質聚集這兩個與人類衰老和年齡相關疾病（包括阿爾茨海默病）相關的主要標誌之間建立了合理的機制聯繫。 通過這樣做，我們的觀察為誘變在人類體愛飛機杯陰蒂高潮液陰莖增大藥陰莖增大膏陰莖增大器速效雙效藥速效持久藥速效勃起藥迷情型藥費洛蒙香水聽話型乖乖水男性用藥男性外抹藥淫汁水昏睡藥持久延時液女性春藥女性外塗失憶型藥增慾按摩油增慾催情藥口交潤滑液印度神油液催情藥保養增強藥乳頭刺激液衰老和疾病中的作用提供了新的見解，並提出了類澱粉樣和朊病毒樣疾病發展的合理機制。
結果：
為了測試轉錄錯誤是否產生類澱粉樣或朊病毒樣蛋白，我們使用大規模平行測序方法 circ-seq 檢測了人類胚胎幹細胞（H1 ESCs）、腦類器官、神經元和成纖維細胞的轉錄組。 腦類器官和神經元由 H1 ESCs 直接生成，因此這些模型之間的遺傳背景保持一致，結果可以相互比較。 此外，我們對 H1 ESCs 進行了 300 倍覆蓋度的測序，以生成定製的參考基因組，並確保排除單核苷酸多態性或低水準突變。 總之，這些測序工作在所有三種模型中產生了超過160,000個影響超過11,000個基因的轉錄錯誤。 每個模型顯示出相似的錯誤率和頻譜，表明轉錄錯誤率在很大程度上與細胞命運、增殖率和分化狀態無關。 不過，我們確實觀察到 H1 ESCs 細胞中 A→G 錯誤明顯增加，這反映了 A 到 I RNA 編輯對轉錄組的影響。
然後，我們使用兩種方法來確定這些錯誤是否導致類澱粉樣或類澱粉樣蛋白：基於文獻的方法和生物資訊學方法。 在基於文獻的方法中，我們關注了 70 種直接與各種類澱粉樣和類澱粉樣疾病有關的蛋白質，包括 PRNP（克雅氏病和格斯特曼 - 施特勞斯勒 - 謝克爾綜合征）、APP（阿爾茨海默病）、SOD1、FUS（肌萎縮側索硬化症）和 TTR（轉甲狀腺素蛋白澱粉樣變性）。 在過去的 30 年中，這些蛋白質中的數百個突變已被確定導致家族性蛋白質病病例。 在大多數情況下，這些突變極大地增加了受影響蛋白質的類澱粉樣和朊病毒樣潛力。 我們推斷，如果轉錄錯誤產生相同的突變蛋白，它們也可能導致致病性蛋白質。 為了識別這些錯誤，我們將檢測到的錯誤與編目與蛋白質聚集疾病有關的種系突變的各種資料庫（包括 Clinvar 和人類基因組突變資料庫）進行交叉引用。 在影響類澱粉樣和類澱粉樣蛋白的 1936 個錯誤中，我們確定了 38 個產生在臨床上已見過的突變蛋白的錯誤。 例如，我們檢測到的兩個錯誤產生了 SOD1 和 FUS 蛋白的突變版本，這兩種蛋白在家族性肌萎縮側索硬化症病例中均被鑒定，而另一個錯誤產生了導致格斯特曼 - 施特勞斯勒 - 謝克爾綜合征的人類朊病毒蛋白（PRNPA133V）的突變版本。 其他錯誤產生了 TTR（澱粉樣變性轉甲狀腺素蛋白澱粉樣變性）、CSTB（進行性肌陣攣性癲癇）、TGFBI（角膜營養不良）、APP（阿爾茨海默病）、CRYGD（珊瑚狀白內障）、TP53（癌症）、Medin（自然衰老）等的病理版本。 此外，我們確定了 75 個影響與疾病直接相關的關鍵氨基酸的錯誤，儘管這些錯誤將這些氨基酸突變為與臨床不同的殘基。 例如，其中一個錯誤產生了 PRNP（PRNPV210A）的突變版本，與家族性克雅氏病相關的 PRNPV210I 突變非常相似（丙氨酸和異亮氨酸都是脂肪族氨基酸）。 在編碼 APP、CSTB、HNRNPA1（包含體肌病伴額顳葉失智）、TGFBI、TP53、TTR 和其他 10 種蛋白質的轉錄本中也存在類似的錯誤。 這些錯誤中的很大一部分可能也會影響這些蛋白質的類澱粉樣行為。
為了證實通過我們基於文獻的方法確定的錯誤確實導致具有類澱粉樣或類澱粉樣行為的蛋白質，我們選擇了兩個候選者進行後續實驗。 其中一個錯誤產生了 SOD1（SOD1G142E）的突變版本，第二個錯誤產生了 FUS（FUSR521H）的突變版本。 這些突變蛋白先前在家族性肌萎縮側索硬化症病例中被鑒定。 我們通過慢病毒轉染在原代人成纖維細胞、HEK293 細胞和膠質母細胞瘤細胞中表達這些蛋白質，然後通過共聚焦顯微鏡對其進行成像。 與轉錄錯誤產生顯示類澱粉樣行為的突變蛋白的觀點一致，我們發現 SOD1G142E 和 FUSR521H 在所有三種細胞類型中均聚集，而野生型蛋白質則沒有。 此外，我們發現突變的SOD1和FUS蛋白定位錯誤。 野生型 FUS 主要存在於細胞核中（在那裡它有助於 RNA 剪接、基因表達和 DNA 修復），而突變蛋白被排除在細胞核外，並在整個細胞質中形成大的點狀沉積物。 類似地，SOD1 通常分佈在細胞質和細胞核中，但我們發現 SOD1G142E 被排除在細胞核外，並在細胞質中形成大的蛋白質沉積物。 重要的是，FUS 和 SOD1 的核排除和蛋白質聚集是與肌萎縮側索硬化症相關的病理學的關鍵組成部分。 當我們通過用來自 SOD1_G142E 範本的 mRNA 轉染 3T3 細胞來類比轉錄誘變時，我們觀察到了相同的定位錯誤和聚集。 這些 mRNA 產生的蛋白質聚集體至少在 7 天內（我們在該實驗中的最新時間點）仍然可見，表明它們在合成后持續存在很長時間。 最後，我們使用慢病毒轉導在同一細胞中共表達野生型和突變型 SOD1 並監測它們的行為。 我們發現當與 SOD1G142E 共表達時，野生型 SOD1 不再均勻分佈在細胞中，而是被排除在細胞核外，並與 SOD1G142E 組裝成相同的類澱粉樣沉積物，這表明野生型 SOD1 被 SOD1G142E 招募並轉化為類澱粉樣狀態。 對於野生型和突變型 FUSR521H，我們也有類似的觀察。 野生型 FUS 在 FUSR521H 存在的情況下幾乎總是被排除在細胞核外，並與 FUSR521H 一起隔離在細胞質沉積物中，儘管也有罕見的例外。 與 SOD1G142E 具有類澱粉樣特性的觀點一致，透射電子顯微鏡表明突變型 SOD1 可以在體外形成類澱粉樣纖維。 綜合來看，這些實驗為轉錄錯誤產生類澱粉樣蛋白的觀點提供了重要的原理證明。 此外，由於 RNAPII 在細胞內不斷產生新的 mRNA 分子，並且 RNAPII 的轉錄相對容易出錯（轉錄錯誤率約比突變率高 100 倍以上），我們得出結論，轉錄錯誤在人類細胞中產生了連續的類澱粉樣和類澱粉樣蛋白流。
除了與疾病直接相關的蛋白質外，我們想知道轉錄錯誤是否也能產生其類澱粉樣特性尚未表徵的突變蛋白。 為了測試這個假設，我們使用了一種無偏的生物資訊學方法來分析錯誤對類澱粉樣和類澱粉樣蛋白的影響。 首先，我們使用AmyPred-FRL分析影響類澱粉樣和朊病毒樣蛋白的錯誤，發現457個被預測會增加其類澱粉樣潛力。 其次，我們使用PAPA分析影響具有朊病毒樣結構域的蛋白質的錯誤。 儘管PRNP基因編碼人類中的典型朊病毒蛋白，但現在已知許多蛋白質都含有朊病毒樣結構域。 這些結構域中的突變可以在包括蛋白毒性疾病在內的各種情況下增加這些蛋白質的朊病毒樣行為。 通過將此演算法應用於我們的數據集，我們發現 393 個轉錄錯誤被預測會表現出增加的類澱粉樣和朊病毒樣行為。
接下來，我們從 Prionscan、PLAAC 和澱粉樣蛋白資料庫中提取資訊，構建了一個有可能顯示類澱粉樣和朊病毒樣特徵的蛋白質的綜合資料庫。 然後，我們將此資料庫與我們檢測到的轉錄錯誤進行交叉引用，以識別可能增強這些特徵的錯誤。 為了測試這些預測的準確性，我們更詳細地檢查了影響 TP53 蛋白的錯誤。 TP53 是一種參與DNA修復、轉錄、細胞衰老和凋亡的重要腫瘤抑制蛋白，在15%的人類癌症中聚集。 使用上述生物資訊學工具，我們確定了 5 個可能增加 TP53 澱粉樣傾向的轉錄錯誤：TP53S149F、TP53G245S、TP53G279A、TP53S315F 和 TP53P318L。 當我們將這些突變映射到 TP53 的晶體結構時，我們注意到 S149F 突變（圖 3A）位於 TP53β夾心核心邊緣的一個環（環 146-WVDSTPPPGTR-156）中。 基於其位置和引入的結構變化（圖 3B，C），我們預測該突變可能會增加局部肽序列（146-WVDSTPPPGTR-156 環）的類澱粉樣傾向，並增強單獨 TP53 單體的β夾心核心之間的相互作用，從而導致形成類澱粉樣蛋白特有的擴展β片層結構。 TTR 蛋白β夾心核心邊緣環中的突變先前已被證明通過類似的基於結構的機制促進澱粉樣形成。 為了驗證這一假設，我們在細菌細胞中表達了野生型和突變型 TP53（aa 92-292）的核心結構域，並通過透射電子顯微鏡分析了這些蛋白質的行為。 與我們的預測一致，我們發現 TP53S149F 確實聚集為大的蛋白質沉積物，而野生型 TP53 則沒有。 這些聚集體在偏振光下顯示剛果紅雙折射，這是澱粉樣形成的有力指標。 我們得出結論，除了直接與疾病相關的類澱粉樣蛋白外，轉錄錯誤還可以產生具有類澱粉樣行為的未表徵的突變蛋白。
接下來，我們決定測試 TP53S149F 是否能像 SOD1G142E 和 FUSR521H 一樣將野生型 TP53 轉化為類澱粉樣狀態，如果可以，啟動這一過程需要多少 TP53S149F。 為了回答這個問題，我們向野生型 TP53 溶液中添加了極少量的 TP53S149F，通過透射電子顯微鏡發現 1%的 TP53S149F（v/v）足以啟動野生型蛋白質的聚集（圖 3H）。 我們在動態光散射實驗中證實了這些發現（圖 3I-K），該實驗表明野生型 TP53 的大小與 TP53 單體一致，而 TP53S149F 聚集成比其大 100 倍以上的沉積物。 此外，當我們向野生型溶液中添加 2%（v/v）的 TP53S149F 時，我們觀察到 TP53 聚集體不成比例地增加，這隻能用突變型誘導的野生型蛋白質聚集來解釋。 最後，我們使用原子力顯微鏡（AFM）進一步表徵野生型和突變型 TP53 之間的交叉播種行為。 首先，我們通過超聲和離心製備了 TP53S149F 聚集體的播種溶液（圖 3L），其由多角形和螺旋形結構組成，通過多角度光散射（MALS）和 AFM 測定的平均粒徑為 0.1μm。 大小為 0.1μm 的顆粒大致相當於約 800-1000 個分子，這一數量可能由 1 個或幾個突變轉錄本的翻譯產生（圖 3M）。 然後，我們將這些顆粒以 2%v/v 的比例混入野生型 TP53 溶液（圖 3N）中，並觀察到野生型 TP53 纖維的顯著種子依賴性生長（圖 3O）。 給予足夠的孵育時間，突變型與野生型蛋白質 1：50 的混合物產生了肉眼可見的沉積物（圖 3P）。 考慮到這些聚集體的大小，這些沉積物幾乎完全由野生型蛋白質構成，突變型蛋白質作為初始種子。
為了擴展這些觀察結果並確保這種現象不是由諸如 AFM 樣品製備（涉及在雲母表面乾燥樣品）等人為因素引起的，我們開發了一種懸滴法來表徵溶液中的播種過程（圖 4A-C）。 首先，我們製備了平均大小為 0.1μm 的從細菌中收穫的 TP53S149F 顆粒的播種溶液，通過 MALS 和 AFM 測定（補充表 3）。 然後，我們設置了一個 46 的篩選托盤，其中有一個 1ml 的含有蛋白質緩衝液和遞增濃度的 NaCl（分別為 0.3、0.5、0.7、0.8、1.0、1.2M，對於第 1-6 列）的儲存溶液。 最後，我們將 10μl 的野生型 TP53 溶液（60μM）添加到矽化蓋玻片上，並將 1μl 的不同濃度（從 A
儘管長期以來一直懷疑轉錄錯誤在這些結構的形成中起作用，但由於與錯誤檢測相關的技術限制，很難驗證這一假設。 為解決此問題，我們最近優化了一種稱為圓環測序的 RNA 測序工具，它能夠對 mRNA 分子進行高保真測序。 在此，我們使用圓環測序證明轉錄錯誤在人類細胞中普遍存在，並且確實導致具有類澱粉樣和朊病毒樣特性的蛋白質。 我們通過各種細胞、生化和生物物理實驗支援了這些觀察結果，這些實驗表明這些錯誤產生的蛋白質能夠成功地將野生型蛋白質轉化為類澱粉樣狀態，然後自我組裝成具有各種結構的蛋白質聚集體。 最後，我們表明由於DNA損傷，導致啟動大規模蛋白質聚集所需的突變蛋白數量通常會超過閾值，這是衰老細胞的普遍標誌。 因此，我們的實驗在DNA損傷和蛋白質聚集這兩個與人類衰老和年齡相關疾病（包括阿爾茨海默病）相關的主要標誌之間建立了合理的機制聯繫。 通過這樣做，我們的觀察為誘變在人類體愛飛機杯陰蒂高潮液陰莖增大藥陰莖增大膏陰莖增大器速效雙效藥速效持久藥速效勃起藥迷情型藥費洛蒙香水聽話型乖乖水男性用藥男性外抹藥淫汁水昏睡藥持久延時液女性春藥女性外塗失憶型藥增慾按摩油增慾催情藥口交潤滑液印度神油液催情藥保養增強藥乳頭刺激液衰老和疾病中的作用提供了新的見解，並提出了類澱粉樣和朊病毒樣疾病發展的合理機制。
結果：
- 轉錄錯誤在人類細胞中普遍存在
為了測試轉錄錯誤是否產生類澱粉樣或朊病毒樣蛋白，我們使用大規模平行測序方法 circ-seq 檢測了人類胚胎幹細胞（H1 ESCs）、腦類器官、神經元和成纖維細胞的轉錄組。 腦類器官和神經元由 H1 ESCs 直接生成，因此這些模型之間的遺傳背景保持一致，結果可以相互比較。 此外，我們對 H1 ESCs 進行了 300 倍覆蓋度的測序，以生成定製的參考基因組，並確保排除單核苷酸多態性或低水準突變。 總之，這些測序工作在所有三種模型中產生了超過160,000個影響超過11,000個基因的轉錄錯誤。 每個模型顯示出相似的錯誤率和頻譜，表明轉錄錯誤率在很大程度上與細胞命運、增殖率和分化狀態無關。 不過，我們確實觀察到 H1 ESCs 細胞中 A→G 錯誤明顯增加，這反映了 A 到 I RNA 編輯對轉錄組的影響。
- 轉錄錯誤產生與疾病相關的蛋白質
然後，我們使用兩種方法來確定這些錯誤是否導致類澱粉樣或類澱粉樣蛋白：基於文獻的方法和生物資訊學方法。 在基於文獻的方法中，我們關注了 70 種直接與各種類澱粉樣和類澱粉樣疾病有關的蛋白質，包括 PRNP（克雅氏病和格斯特曼 - 施特勞斯勒 - 謝克爾綜合征）、APP（阿爾茨海默病）、SOD1、FUS（肌萎縮側索硬化症）和 TTR（轉甲狀腺素蛋白澱粉樣變性）。 在過去的 30 年中，這些蛋白質中的數百個突變已被確定導致家族性蛋白質病病例。 在大多數情況下，這些突變極大地增加了受影響蛋白質的類澱粉樣和朊病毒樣潛力。 我們推斷，如果轉錄錯誤產生相同的突變蛋白，它們也可能導致致病性蛋白質。 為了識別這些錯誤，我們將檢測到的錯誤與編目與蛋白質聚集疾病有關的種系突變的各種資料庫（包括 Clinvar 和人類基因組突變資料庫）進行交叉引用。 在影響類澱粉樣和類澱粉樣蛋白的 1936 個錯誤中，我們確定了 38 個產生在臨床上已見過的突變蛋白的錯誤。 例如，我們檢測到的兩個錯誤產生了 SOD1 和 FUS 蛋白的突變版本，這兩種蛋白在家族性肌萎縮側索硬化症病例中均被鑒定，而另一個錯誤產生了導致格斯特曼 - 施特勞斯勒 - 謝克爾綜合征的人類朊病毒蛋白（PRNPA133V）的突變版本。 其他錯誤產生了 TTR（澱粉樣變性轉甲狀腺素蛋白澱粉樣變性）、CSTB（進行性肌陣攣性癲癇）、TGFBI（角膜營養不良）、APP（阿爾茨海默病）、CRYGD（珊瑚狀白內障）、TP53（癌症）、Medin（自然衰老）等的病理版本。 此外，我們確定了 75 個影響與疾病直接相關的關鍵氨基酸的錯誤，儘管這些錯誤將這些氨基酸突變為與臨床不同的殘基。 例如，其中一個錯誤產生了 PRNP（PRNPV210A）的突變版本，與家族性克雅氏病相關的 PRNPV210I 突變非常相似（丙氨酸和異亮氨酸都是脂肪族氨基酸）。 在編碼 APP、CSTB、HNRNPA1（包含體肌病伴額顳葉失智）、TGFBI、TP53、TTR 和其他 10 種蛋白質的轉錄本中也存在類似的錯誤。 這些錯誤中的很大一部分可能也會影響這些蛋白質的類澱粉樣行為。
- 轉錄錯誤產生與疾病相關的類澱粉樣蛋白
為了證實通過我們基於文獻的方法確定的錯誤確實導致具有類澱粉樣或類澱粉樣行為的蛋白質，我們選擇了兩個候選者進行後續實驗。 其中一個錯誤產生了 SOD1（SOD1G142E）的突變版本，第二個錯誤產生了 FUS（FUSR521H）的突變版本。 這些突變蛋白先前在家族性肌萎縮側索硬化症病例中被鑒定。 我們通過慢病毒轉染在原代人成纖維細胞、HEK293 細胞和膠質母細胞瘤細胞中表達這些蛋白質，然後通過共聚焦顯微鏡對其進行成像。 與轉錄錯誤產生顯示類澱粉樣行為的突變蛋白的觀點一致，我們發現 SOD1G142E 和 FUSR521H 在所有三種細胞類型中均聚集，而野生型蛋白質則沒有。 此外，我們發現突變的SOD1和FUS蛋白定位錯誤。 野生型 FUS 主要存在於細胞核中（在那裡它有助於 RNA 剪接、基因表達和 DNA 修復），而突變蛋白被排除在細胞核外，並在整個細胞質中形成大的點狀沉積物。 類似地，SOD1 通常分佈在細胞質和細胞核中，但我們發現 SOD1G142E 被排除在細胞核外，並在細胞質中形成大的蛋白質沉積物。 重要的是，FUS 和 SOD1 的核排除和蛋白質聚集是與肌萎縮側索硬化症相關的病理學的關鍵組成部分。 當我們通過用來自 SOD1_G142E 範本的 mRNA 轉染 3T3 細胞來類比轉錄誘變時，我們觀察到了相同的定位錯誤和聚集。 這些 mRNA 產生的蛋白質聚集體至少在 7 天內（我們在該實驗中的最新時間點）仍然可見，表明它們在合成后持續存在很長時間。 最後，我們使用慢病毒轉導在同一細胞中共表達野生型和突變型 SOD1 並監測它們的行為。 我們發現當與 SOD1G142E 共表達時，野生型 SOD1 不再均勻分佈在細胞中，而是被排除在細胞核外，並與 SOD1G142E 組裝成相同的類澱粉樣沉積物，這表明野生型 SOD1 被 SOD1G142E 招募並轉化為類澱粉樣狀態。 對於野生型和突變型 FUSR521H，我們也有類似的觀察。 野生型 FUS 在 FUSR521H 存在的情況下幾乎總是被排除在細胞核外，並與 FUSR521H 一起隔離在細胞質沉積物中，儘管也有罕見的例外。 與 SOD1G142E 具有類澱粉樣特性的觀點一致，透射電子顯微鏡表明突變型 SOD1 可以在體外形成類澱粉樣纖維。 綜合來看，這些實驗為轉錄錯誤產生類澱粉樣蛋白的觀點提供了重要的原理證明。 此外，由於 RNAPII 在細胞內不斷產生新的 mRNA 分子，並且 RNAPII 的轉錄相對容易出錯（轉錄錯誤率約比突變率高 100 倍以上），我們得出結論，轉錄錯誤在人類細胞中產生了連續的類澱粉樣和類澱粉樣蛋白流。
- 轉錄錯誤產生未表徵的類澱粉樣蛋白
除了與疾病直接相關的蛋白質外，我們想知道轉錄錯誤是否也能產生其類澱粉樣特性尚未表徵的突變蛋白。 為了測試這個假設，我們使用了一種無偏的生物資訊學方法來分析錯誤對類澱粉樣和類澱粉樣蛋白的影響。 首先，我們使用AmyPred-FRL分析影響類澱粉樣和朊病毒樣蛋白的錯誤，發現457個被預測會增加其類澱粉樣潛力。 其次，我們使用PAPA分析影響具有朊病毒樣結構域的蛋白質的錯誤。 儘管PRNP基因編碼人類中的典型朊病毒蛋白，但現在已知許多蛋白質都含有朊病毒樣結構域。 這些結構域中的突變可以在包括蛋白毒性疾病在內的各種情況下增加這些蛋白質的朊病毒樣行為。 通過將此演算法應用於我們的數據集，我們發現 393 個轉錄錯誤被預測會表現出增加的類澱粉樣和朊病毒樣行為。
接下來，我們從 Prionscan、PLAAC 和澱粉樣蛋白資料庫中提取資訊，構建了一個有可能顯示類澱粉樣和朊病毒樣特徵的蛋白質的綜合資料庫。 然後，我們將此資料庫與我們檢測到的轉錄錯誤進行交叉引用，以識別可能增強這些特徵的錯誤。 為了測試這些預測的準確性，我們更詳細地檢查了影響 TP53 蛋白的錯誤。 TP53 是一種參與DNA修復、轉錄、細胞衰老和凋亡的重要腫瘤抑制蛋白，在15%的人類癌症中聚集。 使用上述生物資訊學工具，我們確定了 5 個可能增加 TP53 澱粉樣傾向的轉錄錯誤：TP53S149F、TP53G245S、TP53G279A、TP53S315F 和 TP53P318L。 當我們將這些突變映射到 TP53 的晶體結構時，我們注意到 S149F 突變（圖 3A）位於 TP53β夾心核心邊緣的一個環（環 146-WVDSTPPPGTR-156）中。 基於其位置和引入的結構變化（圖 3B，C），我們預測該突變可能會增加局部肽序列（146-WVDSTPPPGTR-156 環）的類澱粉樣傾向，並增強單獨 TP53 單體的β夾心核心之間的相互作用，從而導致形成類澱粉樣蛋白特有的擴展β片層結構。 TTR 蛋白β夾心核心邊緣環中的突變先前已被證明通過類似的基於結構的機制促進澱粉樣形成。 為了驗證這一假設，我們在細菌細胞中表達了野生型和突變型 TP53（aa 92-292）的核心結構域，並通過透射電子顯微鏡分析了這些蛋白質的行為。 與我們的預測一致，我們發現 TP53S149F 確實聚集為大的蛋白質沉積物，而野生型 TP53 則沒有。 這些聚集體在偏振光下顯示剛果紅雙折射，這是澱粉樣形成的有力指標。 我們得出結論，除了直接與疾病相關的類澱粉樣蛋白外，轉錄錯誤還可以產生具有類澱粉樣行為的未表徵的突變蛋白。
接下來，我們決定測試 TP53S149F 是否能像 SOD1G142E 和 FUSR521H 一樣將野生型 TP53 轉化為類澱粉樣狀態，如果可以，啟動這一過程需要多少 TP53S149F。 為了回答這個問題，我們向野生型 TP53 溶液中添加了極少量的 TP53S149F，通過透射電子顯微鏡發現 1%的 TP53S149F（v/v）足以啟動野生型蛋白質的聚集（圖 3H）。 我們在動態光散射實驗中證實了這些發現（圖 3I-K），該實驗表明野生型 TP53 的大小與 TP53 單體一致，而 TP53S149F 聚集成比其大 100 倍以上的沉積物。 此外，當我們向野生型溶液中添加 2%（v/v）的 TP53S149F 時，我們觀察到 TP53 聚集體不成比例地增加，這隻能用突變型誘導的野生型蛋白質聚集來解釋。 最後，我們使用原子力顯微鏡（AFM）進一步表徵野生型和突變型 TP53 之間的交叉播種行為。 首先，我們通過超聲和離心製備了 TP53S149F 聚集體的播種溶液（圖 3L），其由多角形和螺旋形結構組成，通過多角度光散射（MALS）和 AFM 測定的平均粒徑為 0.1μm。 大小為 0.1μm 的顆粒大致相當於約 800-1000 個分子，這一數量可能由 1 個或幾個突變轉錄本的翻譯產生（圖 3M）。 然後，我們將這些顆粒以 2%v/v 的比例混入野生型 TP53 溶液（圖 3N）中，並觀察到野生型 TP53 纖維的顯著種子依賴性生長（圖 3O）。 給予足夠的孵育時間，突變型與野生型蛋白質 1：50 的混合物產生了肉眼可見的沉積物（圖 3P）。 考慮到這些聚集體的大小，這些沉積物幾乎完全由野生型蛋白質構成，突變型蛋白質作為初始種子。
為了擴展這些觀察結果並確保這種現象不是由諸如 AFM 樣品製備（涉及在雲母表面乾燥樣品）等人為因素引起的，我們開發了一種懸滴法來表徵溶液中的播種過程（圖 4A-C）。 首先，我們製備了平均大小為 0.1μm 的從細菌中收穫的 TP53S149F 顆粒的播種溶液，通過 MALS 和 AFM 測定（補充表 3）。 然後，我們設置了一個 46 的篩選托盤，其中有一個 1ml 的含有蛋白質緩衝液和遞增濃度的 NaCl（分別為 0.3、0.5、0.7、0.8、1.0、1.2M，對於第 1-6 列）的儲存溶液。 最後，我們將 10μl 的野生型 TP53 溶液（60μM）添加到矽化蓋玻片上，並將 1μl 的不同濃度（從 A
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