GFHDT: 紅松花椒和紫薇植物來源外泌體提取物對皮膚屏障增強和保濕效果的研究
紅松花椒和紫薇植物來源外泌體提取物對皮膚屏障增強和保濕效果的研究
14 Mar 2026 at 11:22pm
本研究探討了花椒（Zanthoxylum piperitum）、紫薇（Lagerstroemia indica）和紅松（Pinus densiflora）植物來源的外泌體提取物對HaCaT細胞皮膚屏障改善和保濕的效果。 外泌體處理降低了炎症性IL-6表達，增強了前膠原和透明質酸的產生，同時抑制了MMP-1、膠原酶和彈性蛋白酶的活性。 這些發現表明，植物來源的外泌體可以有效加強皮膚屏障並改善皮膚水合度，支援其在化妝品開發中的潛在應用。
摘要
外泌體是納米級顆粒，結構類似於細胞，因其能有效通過皮膚毛孔吸收且不會分解活性成分而被視為優質化妝品原料而受到關注。 本研究使用HaCaT細胞評估了花椒（Zanthoxylum piperitum）、紫薇（Lagerstroemia indica）和紅松（Pinus densiflora）植物來源的外泌體提取物對皮膚屏障增強和保濕的效果。 通過MTS實驗確認細胞活性，並通過分析TNF-α/IFN-γ誘導的炎症反應中白細胞介素（IL）-6的表達來評估皮膚屏障改善效果。 此外，測量了前膠原、基質金屬蛋白酶（MMP）-1、透明質酸、膠原酶抑制活性和彈性蛋白酶抑制活性，以驗證保濕效果。 研究結果表明，外泌體處理不影響HaCaT細胞的活性，並通過降低因TNF-α/IFN-γ處理而增加的IL-6表達，確認了皮膚屏障改善效果。 此外，外泌體處理后，前膠原和透明質酸的表達增加，MMP-1表達降低，並觀察到膠原酶和彈性蛋白酶抑制活性的顯著改善，表明具有皮膚保濕效果。 本研究結果表明，紅松（Pinus densiflora）、花椒（Zanthoxylum piperitum）和紫薇（Lagerstroemia indica）植物來源的外泌體提取物有助於增強皮膚屏障和保濕，為基於外泌體的化妝品原料開發提供了基礎數據。
關鍵詞：外泌體; 皮膚屏障; 保濕效果; 花椒（Zanthoxylum piperitum）; 紫薇（Lagerstroemia indica）; 紅松（Pinus densiflora）
1. 引言
皮膚作為人體最大且功能多樣的器官，由三層主要結構組成：表皮、真皮和皮下組織。 皮膚作為一個複雜的屏障，保護內部系統免受外部環境的影響[1,2]。 表皮屏障起到化學和物理防禦作用，防止水分通過皮膚流失，並在陸地環境中維持穩態[3,4]。 外層角質層由無核的角質細胞嵌入富含神經醯胺、膽固醇和脂肪酸的脂質層中組成，共同構成主要的滲透屏障[5,6]。 主要位於顆粒層的緊密連接提供額外的屏障，防止細胞間滲透[7]，與脂質層協同作用，維持水分並保護免受外部壓力[8,9,10,11,12]。 當這些結構元素受損時，屏障功能受損會導致水分過度蒸發，並增加對微生物或過敏原侵入的易感性[13]。
異常或過度的免疫反應會干擾正常的皮膚屏障功能並導致其受損[14]。 Th1和Th2驅動的細胞因數反應失衡導致慢性皮膚炎症。 特別是，Th2相關的白細胞介素（如IL-4、IL-6和IL-13）水準升高與皮膚疾病中觀察到的屏障破壞和持續性炎症密切相關[15,16]。 促炎細胞因數（如TNF-α和IFN-γ）的過度產生會阻礙角質形成細胞成熟，減少緊密連接組分的表達，並干擾正常脂質代謝[17]。 傳統療法，包括使用富含神經醯胺的保濕劑，在修復皮膚屏障方面成效有限，突顯了維持皮膚穩態需要平衡的結構和生化調節[18,19]。
近年來，細胞外囊泡（EVs），如外泌體，作為創新的生物活性載體，在組織再生和皮膚病治療中展現出前景，引起了關注[20]。 外泌體是微小的膜包被囊泡，通常大小為30–150 nm，由各種細胞類型分泌。 它們含有多種生物分子，包括蛋白質、脂質和核酸，在介導細胞間通訊中起關鍵作用[21,22]。 與人工納米顆粒相比，外泌體天然具有高生物相容性和結構穩定性，能夠在最小化免疫反應的同時有效遞送生物活性物質[23]。 植物來源的外泌體由於其天然來源和多樣的生物活性，最近在化妝品領域引起了越來越多的興趣[24]。 研究表明，植物來源的外泌體可以刺激膠原蛋白產生，減輕氧化損傷，並支持皮膚再生[25]。 這些囊泡為旨在抗衰老和增強皮膚屏障的產品中的合成成分提供了潛在的天然替代品[2台灣雄獅藥局官網雄獅藥局線上訂購雄獅藥局暢銷商品關於雄獅藥局雄獅藥局獨家資訊雄獅藥局優惠券雄獅藥局配送方式雄獅藥局全部商品台灣雄獅藥局必買產品台灣雄獅藥局5折訂購
6]。 儘管越來越多的研究強調了它們的治療潛力，但植物來源外泌體在維持或修復表皮屏障方面的精確功能仍研究不足。
在本研究中，我們調查了從紅松（Pinus densiflora）葉子、花椒（Zanthoxylum piperitum）果實和紫薇（Lagerstroemia indica）花朵中分離的外泌體提取物對人類角質形成細胞的保護和修復作用。 我們重點評估了它們調節細胞因數誘導的屏障破壞以及促進關鍵皮膚屏障和保濕相關生物標誌物表達的能力。 儘管對外泌體基化妝品材料的興趣日益增長，但關於植物來源外泌體的生物活性的資訊仍然有限，特別是從花椒（Zanthoxylum piperitum）、紫薇（Lagerstroemia indica）和紅松（Pinus densiflora）獲得的外泌體。 在這項工作中，我們比較研究了從這三種植物來源提取的外泌體的皮膚屏障保護和保濕特性。 據我們所知，這是首次系統評估它們對人類角質形成細胞中表皮炎症、細胞外基質調節和水合相關通路的影響的研究。 這些發現有望為植物來源外泌體作為創新化妝品成分的潛在應用提供新的見解。
2. 材料與方法
2.1 外泌體的分離與純化
將紫薇（Lagerstroemia indica）花朵、花椒（Zanthoxylum piperitum）果實和紅松（Pinus densiflora）針葉分別在三蒸水中勻漿。 經過濾網過濾后，勻漿依次在4C下離心（3500g 15分鐘→15,000g 30分鐘→23,000g 45分鐘）以分離上清液。 收集的上清液通過0.45μm膜過濾器（韓國現代微系統公司）過濾。 濾液使用配備300 kDa膜的切向流過濾（TFF）系統（Minimate TFF膠囊300K OMEGA膜，Pall公司）濃縮和純化十倍。 濃縮液進一步通過0.2μm膜過濾器（韓國現代微系統公司）過濾，將每種植物來源的外泌體制備物按1：1：1比例混合進行後續實驗。 製備的外泌體樣品儲存在-80C直至使用。
2.2 細胞培養
為評估外泌體的作用，我們使用了人角質形成細胞HaCaT細胞（Cell Line Service GmBH公司）。 細胞在含有10%胎牛血清（FBS）和青黴素-鏈黴素硫酸鹽（100單位/mL和100μg/mL）的杜爾貝科改良鷹培養基（DMEM）中培養，培養條件為37C、5% CO₂環境。 細胞維持在培養密度低於110⁵個細胞/mL的條件下。
2.3 細胞毒性實驗
將處於指數生長期的HaCaT細胞以110⁵個細胞/孔接種在96孔培養板中，並用不同劑量的外泌體（1至1000μg/mL）處理24小時。 然後使用MTS試劑（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑內鹽）（Promega公司）評估細胞。 向每孔加入10μL MTS溶液，細胞額外培養4小時。 使用微孔板分光光度計（Multiskan Go，Thermo Scientific公司）測量490 nm處的光密度。 對照細胞被認為100%存活。 我們選擇了較低的外泌體實驗劑量。
2.4 ELISA生物標誌物分析
將HaCaT細胞以510⁵個細胞/mL的密度接種到6孔板中並培養。 更換含各種濃度測試樣品的新鮮培養基后，將細胞培養24小時。 收集的上清液用於評估皮膚保濕功效。 使用ELISA試劑盒（R&
Systems公司）定量炎症細胞因數IL-6。 使用ELISA試劑盒定量保濕活性的生物標誌物，包括I型前膠原（Abcam公司）、基質金屬蛋白酶（MMP）-1（Abcam公司）、透明質酸（R& Systems公司）、膠原酶（Invitrogen公司）和彈性蛋白酶（Invitrogen公司）。
2.5 西部印跡分析
獲取培養細胞的全細胞裂解物，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，並進行西部印跡分析。 我們從Abcam公司購買了包括抗ASAH1、抗SHMT1、抗SPTLC1、抗包殼蛋白、抗PPAR-α、抗彈性蛋白和抗HAS-2在內的主要抗體。 抗絲聚蛋白（Thermo Fisher Scientific公司）、抗HAS-3（Santa Cruz公司）和抗p53、抗COL-1（Cell Signaling Technology公司）抗體分別從相應公司購買。
2.6 透射電子顯微鏡分析
使用透射電子顯微鏡（TEM; H-7600，日立公司）在80 kV加速電壓下檢查樣品的形態特徵。 對於TEM製備，將10μL顆粒懸浮液置於formvar/carbon塗層銅網上，吸附約1分鐘。 用濾紙去除多餘液體后，網格用2%（w/v）醋酸鈾負染30秒。 染色后的網格在室溫下完全乾燥，隨後在各種放大倍數下成像以評估顆粒大小和形態。
2.7 奈米顆粒追蹤分析
使用納米顆粒追蹤分析系統（NTA; ZetaView PMX-120，Particle Metrix公司）確定顆粒大小分佈和濃度。 測量前，每種樣品用三蒸水稀釋以獲得適當的顆粒濃度進行分析。 將稀釋后的懸浮液引入儀器，在相同的相機設置下，在11個預定義位置記錄視頻，進行三次連續掃描迴圈。 相機靈敏度設置為85，快門速度固定為100。 使用ZetaView軟體（版本8.05.16 SP7）處理所有記錄的視頻，計算平均顆粒大小、尺寸分佈和顆粒濃度。
2.8 LC-MS/MS脂質譜分析
對於脂質提取，將50μL PBS和50μL脂質標準溶液添加到沉澱樣品中，然後在冰浴中進行尖端超聲處理1分鐘（振幅10%，脈衝開啟：0.5秒，脈衝關閉：0.5秒）。 然後，加入250μL甲醇（MeOH）和1 mL甲基叔丁基醚（MTBE），使用旋轉器渦旋1小時。 加入200μL H₂O后，樣品再次在旋轉器上渦旋10分鐘。 通過在3000g下離心5分鐘實現相分離，將上層轉移到新的Eppendorf管中。 為提取殘留脂質，向剩餘沉澱中加入400μL MTBE，渦旋10分鐘，再次在3000g下離心5分鐘。 將所得上層與先前收集的上清液合併。 將合併的提取物在SpeedVac中完全乾燥過夜，並重新溶解在100μL MeOH：CHCl₃（9：1，v/v）中。 將每種樣品的4μL等分試樣注入UPLC系統的分析柱中。 使用溶劑B（有機相）的線性梯度在30分鐘內分離樣品，流速為0.25 mL/min。 每個樣品分析三次。 使用LipidSearch 4.2.21版進行脂質鑒定。 為確保準確的脂質譜，手動過濾結果中的假陽性峰。
2.9 統計分析
數據表示為均值標準差（SD），所有統計分析均使用Sigmaplot v14.0軟體（Systat Software公司）進行。 通過單向方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較檢驗進行統計分析。 p值<0.05被認為具有顯著性。
3. 結果
3.1 透射電子顯微鏡和納米顆粒追蹤分析對植物來源外泌體的表徵
使用透射電子顯微鏡（TEM）和納米顆粒追蹤分析（NTA）分析了從紫薇（Lagerstroemia indica）花朵、花椒（Zanthoxylum piperitum）果實和紅松（Pinus densiflora）葉子中提取的外泌體提取物的形態和物理特性。 如圖1所示，TEM圖像顯示分離的囊泡表現出典型的杯狀或球形形態，具有完整的脂質雙層膜，與外泌體已知的結構特徵一致。 未觀察到明顯的碎屑或聚集，表明分離和純化過程成功地產生了均勻的囊泡群體。 NTA測量進一步證實了外泌體制備物的納米級尺寸分佈。 顆粒濃度和分佈譜顯示所有三種植物來源之間具有高度一致性，表明外泌體穩定產生且在物理化學性質上具有可比性。 這些結果與TEM和NTA分析一起證實，從紅松、花椒和紫薇中提取的外泌體已成功分離和純化，表現出均勻的形態和納米級尺寸，從而為後續生物學和功能測定提供了特徵明確的囊泡。
3.2 外泌體提取物對人細胞系的毒性
首先，我們通過MTS實驗確定了外泌體對人角質形成細胞HaCaT細胞的潛在毒性。 本研究使用HaCaT角質形成細胞，因為它們作為一種廣泛使用的表皮細胞模型，保留了原代角質形成細胞的基本功能特徵，如分化潛力和對內外部及炎症線索的敏感性。 由於我們研究的重點是表皮屏障完整性和角質形成細胞驅動的炎症事件，該細胞系提供了合適的實驗系統。 相比之下，真皮成纖維細胞主要參與細胞外基質產生和真皮修復過程，因此更適用於以真皮重塑而非表皮生理為中心的研究。 儘管基於成纖維細胞的實驗可以補充我們的發現，但HaCaT細胞是解決本研究中檢查的表皮方面的最合適模型。 圖2所示的結果清楚地表明，外泌體提取物在處理的濃度範圍內未引起細胞毒性。
3.3 外泌體提取物對人細胞系中IL-6水準的抑製作用
為檢驗植物來源外泌體提取物的抗炎作用，在用TNF-α和IFN-γ（各10 ng/mL）刺激后，評估了HaCaT細胞中IL-6的分泌。 如圖3所示，與未處理的對照組相比，細胞因數刺激組的IL-6水平顯著增加，確認了炎症反應的成功誘導。 外泌體提取物處理以劑量依賴性方式顯著降低了IL-6的分泌，表明這些囊泡能有效減輕角質形成細胞中細胞因數誘導的炎症。 在測試條件下，與水提取物處理組（ZLPW組）相比，外泌體處理組顯示出對IL-6表達的明顯更強的抑製作用。 這些發現表明，紅松、花椒和紫薇來源的外泌體通過調節促炎細胞因數的產生，發揮強大的抗炎活性，從而有助於在炎症壓力條件下維持皮膚屏障穩態。
3.4 外泌體提取物在人細胞系中的皮膚屏障增強功能
為進一步闡明植物來源外泌體提取物皮膚屏障增強作用的機制，通過西部印跡分析了TNF-α/IFN-γ刺激的HaCaT細胞中關鍵屏障相關蛋白的表達。 如圖4和圖S1所示，與未處理對照組相比，TNF-α/IFN-γ刺激顯著改變了幾種脂質代謝和神經醯胺合成相關酶的表達，包括ASAH1、SHMT1和SPTLC1。 外泌體提取物處理有效地逆轉了這些變化，顯著恢復了SHMT1和SPTLC1的表達，同時降低了在炎症條件下異常升高的ASAH1水準。 這些結果表明，外泌體提取物有助於正常化脂質代謝和神經醯胺生物合成，從而支持皮膚屏障恢復。 此外，我們檢查了結構和分化相關蛋白的表達，包括包殼蛋白、絲聚蛋白和過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α），它們在維持表皮完整性方面發揮關鍵作用（圖5和圖S1）。 結果表明，TNF-α/IFN-γ刺激顯著降低了這些蛋白的表達，而外泌體提取物處理以劑量依賴性方式顯著恢復了它們的水準。 與水提取物處理組（ZLPW）相比，外泌體處理的細胞顯示出這些屏障相關蛋白的更高上調。
綜合來看，這些結果表明，紅松、花椒和紫薇植物來源的外泌體提取物通過調節脂質代謝相關酶和對表皮分化和功能至關重要的結構蛋白，促進皮膚屏障修復。
3.5 外泌體提取物對MMP-1分泌和I型前膠原降解的抑製作用
I型前膠原是在真皮成纖維細胞中合成的I型膠原的前體。 為研究植物來源外泌體提取物是否影響細胞外基質維持和膠原代謝，在用不同濃度的外泌體（0.1、0.5和1μg/mL）處理后，測量了HaCaT細胞中MMP-1分泌和I型前膠原水準。 如圖6A所示，與未處理對照組相比，TNF-α/IFN-γ刺激顯著增加了MMP-1分泌，表明在炎症條件下基質降解。 外泌體提取物處理以濃度依賴性方式顯著降低了MMP-1水準，表明這些囊泡對細胞外基質降解具有保護作用。 相比之下，I型前膠原的產生在處理後顯著增強（圖6B）。 前膠原水準的增加表明外泌體促進了膠原合成並可能改善了真皮基質重塑。 此外，與植物水提取物處理組（ZLPW組）相比，外泌體處理組顯示出更明顯的效果，暗示外泌體制劑具有更高的生物活性和遞送效率。 這些結果表明，紅松、花椒和紫薇植物來源的外泌體提取物能有效保護皮膚細胞免受基質降解，同時刺激膠原合成，對皮膚具有抗衰老和保濕作用。
3.6 紅松、花椒和紫薇植物來源外泌體提取物對HaCaT細胞保濕活性的影響
為研究紅松、花椒和紫薇植物來源外泌體提取物的保濕和抗衰老作用，我們檢查了它們抑制細胞外基質降解酶和增強HaCaT細胞中關鍵皮膚保濕標誌物的能力。 如圖7所示，與未處理對照組相比，植物來源的外泌體提取物處理顯著抑制了膠原酶（圖7A）和彈性蛋白酶（圖7B）的活性，且呈濃度依賴性。 這種抑製作用表明外泌體通過防止膠原和彈性蛋白降解有效保護細胞外基質，從而有助於維持皮膚彈性和抗衰老潛力。 此外，外泌體處理顯著增加了透明質酸（HA）的產生（圖7C），透明質酸是維持皮膚水分的關鍵潤濕劑。 這些結果表明，外泌體提取物通過酶抑制和刺激保濕因數，增強了皮膚的保水能力。 此外，西部印跡分析證實，與對照組相比，外泌體處理的細胞中I型膠原（COL-1）、彈性蛋白、透明質酸合酶-2（HAS-2）和HAS-3的表達水準顯著上調（圖7D-G和圖S1）。 此外，外泌體處理后，凋亡和細胞衰老的關鍵調節因數p53的表達顯著降低（圖7F，G和圖S1）。 綜合來看，這些發現表明，從三種植物物種提取的外泌體提取物通過增強細胞外基質合成和皮膚保濕，同時減弱凋亡和衰老相關通路並抑制細胞外基質降解，發揮強大的保濕和抗衰老作用。
4. 討論
本研究表明，從紅松、花椒和紫薇中獲得的外泌體提取物對皮膚保濕和屏障強化具有多種積極作用。 組合外泌體制備物減輕了TNF-α/IFN-γ誘導的炎症，並促進了對表皮平衡至關重要的關鍵結構蛋白和脂質代謝調節因數的表達。 總體而言，這些結果表明植物來源的外泌體作為天然生物載體，通過協同抗炎和再生作用恢復受損皮膚。
在HaCaT細胞中檢測到的IL-6分泌減少表明外泌體提取物調節細胞因數依賴性炎症通路。 由於IL-6是一種主要的炎症介質，已知會削弱緊密連接並加劇屏障損傷，其下調表明這些囊泡可能有助於在炎症條件下維持表皮穩定性。 這種免疫調節作用與早期發現一致，即植物來源的細胞外囊泡可以調節MAPK和NF-κB信號通路，導致促炎細胞因數產生減少。
同樣，ASAH1、SHMT1和SPTLC1表達的增加表明外泌體提取物有助於維持角質層結構完整性和滲透控制的脂質重塑和神經醯胺合成過程。 包殼蛋白、絲聚蛋白和PPAR-α表達的恢復進一步表明表皮分化和脂質屏障形成得到改善。 這些發現共同表明，外泌體處理加強了屏障結構，提供了超越單純炎症抑制的持續支援。 此外，外泌體提取物通過促進I型前膠原和透明質酸的合成，同時抑制MMP-1、膠原酶和彈性蛋白酶的活性，增強了細胞外基質組織和保濕。 這些結果表明外泌體有助於防止細胞外基質降解並增強真皮彈性，這與它們富含磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯肌醇（PI）和神經醯胺類別的脂質組成一致，如表1所示。 表1總結了ZPLE樣品中平均峰面積最高的30種脂質，表2總結了主要脂質類別和類別的分類。 通過將每種脂質的平均MS1峰面積除以每個樣品中檢測到的所有脂質的平均MS1峰面積之和，並將值表示為百分比，計算每種脂質的相對豐度。 在樣品中，PE和PI按順序檢測到的比例最高。 這些脂質以其促進囊泡和細胞膜融合以及調節與皮膚保濕相關的信號通路而聞名。
觀察到的廣泛功效可能源於從三種植物來源的外泌體中封裝的獨特代謝物組合。 紅松富含萜烯和多酚，花椒含有具有抗炎潛力的生物鹼和黃酮類化合物，紫薇提供具有強抗氧化特性的三萜和花青素。 這些生物活性化合物的組合可能產生協同效應，與來自單一植物來源的外泌體相比，提高了外泌體的穩定性和功能活性。
綜上所述，這些結果表明植物來源的外泌體可以作為用於皮膚健康的合成納米顆粒的環保、生物相容性替代品。 通過同時體愛飛機杯陰蒂高潮液陰莖增大藥陰莖增大膏陰莖增大器速效雙效藥速效持久藥速效勃起藥迷情型藥費洛蒙香水聽話型乖乖水男性用藥男性外抹藥淫汁水昏睡藥持久延時液女性春藥女性外塗失憶型藥增慾按摩油增慾催情藥口交潤滑液印度神油液催情藥保養增強藥乳頭刺激液
靶向炎症、脂質代謝和細胞外基質合成，它們可能提供針對環境壓力和衰老的全面保護。 然而，需要進一步研究來闡明涉及的精確分子通路，確認體內外囊泡攝取機制，並評估化妝品應用中的配方穩定性。
5. 結論
從花椒、紫薇和紅松中獲得的外泌體提取物被發現通過減輕炎症並恢復TNF-α/IFN-γ刺激的HaCaT細胞中關鍵屏障相關蛋白的表達，加強皮膚屏障功能。 值得注意的是，包括包殼蛋白、絲聚蛋白、PPAR-α、SHMT1和SPTLC1在內的必需結構和調節蛋白的水準得到恢復，導致表皮分化、脂質代謝和神經醯胺產生增強。 此外，這些提取物通過刺激前膠原和透明質酸的合成，抑制MMP-1表達，並促進膠原酶和彈性蛋白酶抑制，展示了顯著的保濕效果。 綜合來看，這些發現表明植物來源的外泌體作為化妝品成分具有強化皮膚屏障完整性和維持水分的強大力量。 它們在恢復皮膚結構和維持水分平衡方面的雙重功能突顯了它們在下一代護膚配方中的潛力，值得進一步研究作為功能性化妝品中的活性成分進行開發。
摘要
外泌體是納米級顆粒，結構類似於細胞，因其能有效通過皮膚毛孔吸收且不會分解活性成分而被視為優質化妝品原料而受到關注。 本研究使用HaCaT細胞評估了花椒（Zanthoxylum piperitum）、紫薇（Lagerstroemia indica）和紅松（Pinus densiflora）植物來源的外泌體提取物對皮膚屏障增強和保濕的效果。 通過MTS實驗確認細胞活性，並通過分析TNF-α/IFN-γ誘導的炎症反應中白細胞介素（IL）-6的表達來評估皮膚屏障改善效果。 此外，測量了前膠原、基質金屬蛋白酶（MMP）-1、透明質酸、膠原酶抑制活性和彈性蛋白酶抑制活性，以驗證保濕效果。 研究結果表明，外泌體處理不影響HaCaT細胞的活性，並通過降低因TNF-α/IFN-γ處理而增加的IL-6表達，確認了皮膚屏障改善效果。 此外，外泌體處理后，前膠原和透明質酸的表達增加，MMP-1表達降低，並觀察到膠原酶和彈性蛋白酶抑制活性的顯著改善，表明具有皮膚保濕效果。 本研究結果表明，紅松（Pinus densiflora）、花椒（Zanthoxylum piperitum）和紫薇（Lagerstroemia indica）植物來源的外泌體提取物有助於增強皮膚屏障和保濕，為基於外泌體的化妝品原料開發提供了基礎數據。
關鍵詞：外泌體; 皮膚屏障; 保濕效果; 花椒（Zanthoxylum piperitum）; 紫薇（Lagerstroemia indica）; 紅松（Pinus densiflora）
1. 引言
皮膚作為人體最大且功能多樣的器官，由三層主要結構組成：表皮、真皮和皮下組織。 皮膚作為一個複雜的屏障，保護內部系統免受外部環境的影響[1,2]。 表皮屏障起到化學和物理防禦作用，防止水分通過皮膚流失，並在陸地環境中維持穩態[3,4]。 外層角質層由無核的角質細胞嵌入富含神經醯胺、膽固醇和脂肪酸的脂質層中組成，共同構成主要的滲透屏障[5,6]。 主要位於顆粒層的緊密連接提供額外的屏障，防止細胞間滲透[7]，與脂質層協同作用，維持水分並保護免受外部壓力[8,9,10,11,12]。 當這些結構元素受損時，屏障功能受損會導致水分過度蒸發，並增加對微生物或過敏原侵入的易感性[13]。
異常或過度的免疫反應會干擾正常的皮膚屏障功能並導致其受損[14]。 Th1和Th2驅動的細胞因數反應失衡導致慢性皮膚炎症。 特別是，Th2相關的白細胞介素（如IL-4、IL-6和IL-13）水準升高與皮膚疾病中觀察到的屏障破壞和持續性炎症密切相關[15,16]。 促炎細胞因數（如TNF-α和IFN-γ）的過度產生會阻礙角質形成細胞成熟，減少緊密連接組分的表達，並干擾正常脂質代謝[17]。 傳統療法，包括使用富含神經醯胺的保濕劑，在修復皮膚屏障方面成效有限，突顯了維持皮膚穩態需要平衡的結構和生化調節[18,19]。
近年來，細胞外囊泡（EVs），如外泌體，作為創新的生物活性載體，在組織再生和皮膚病治療中展現出前景，引起了關注[20]。 外泌體是微小的膜包被囊泡，通常大小為30–150 nm，由各種細胞類型分泌。 它們含有多種生物分子，包括蛋白質、脂質和核酸，在介導細胞間通訊中起關鍵作用[21,22]。 與人工納米顆粒相比，外泌體天然具有高生物相容性和結構穩定性，能夠在最小化免疫反應的同時有效遞送生物活性物質[23]。 植物來源的外泌體由於其天然來源和多樣的生物活性，最近在化妝品領域引起了越來越多的興趣[24]。 研究表明，植物來源的外泌體可以刺激膠原蛋白產生，減輕氧化損傷，並支持皮膚再生[25]。 這些囊泡為旨在抗衰老和增強皮膚屏障的產品中的合成成分提供了潛在的天然替代品[2台灣雄獅藥局官網雄獅藥局線上訂購雄獅藥局暢銷商品關於雄獅藥局雄獅藥局獨家資訊雄獅藥局優惠券雄獅藥局配送方式雄獅藥局全部商品台灣雄獅藥局必買產品台灣雄獅藥局5折訂購
6]。 儘管越來越多的研究強調了它們的治療潛力，但植物來源外泌體在維持或修復表皮屏障方面的精確功能仍研究不足。
在本研究中，我們調查了從紅松（Pinus densiflora）葉子、花椒（Zanthoxylum piperitum）果實和紫薇（Lagerstroemia indica）花朵中分離的外泌體提取物對人類角質形成細胞的保護和修復作用。 我們重點評估了它們調節細胞因數誘導的屏障破壞以及促進關鍵皮膚屏障和保濕相關生物標誌物表達的能力。 儘管對外泌體基化妝品材料的興趣日益增長，但關於植物來源外泌體的生物活性的資訊仍然有限，特別是從花椒（Zanthoxylum piperitum）、紫薇（Lagerstroemia indica）和紅松（Pinus densiflora）獲得的外泌體。 在這項工作中，我們比較研究了從這三種植物來源提取的外泌體的皮膚屏障保護和保濕特性。 據我們所知，這是首次系統評估它們對人類角質形成細胞中表皮炎症、細胞外基質調節和水合相關通路的影響的研究。 這些發現有望為植物來源外泌體作為創新化妝品成分的潛在應用提供新的見解。
2. 材料與方法
2.1 外泌體的分離與純化
將紫薇（Lagerstroemia indica）花朵、花椒（Zanthoxylum piperitum）果實和紅松（Pinus densiflora）針葉分別在三蒸水中勻漿。 經過濾網過濾后，勻漿依次在4C下離心（3500g 15分鐘→15,000g 30分鐘→23,000g 45分鐘）以分離上清液。 收集的上清液通過0.45μm膜過濾器（韓國現代微系統公司）過濾。 濾液使用配備300 kDa膜的切向流過濾（TFF）系統（Minimate TFF膠囊300K OMEGA膜，Pall公司）濃縮和純化十倍。 濃縮液進一步通過0.2μm膜過濾器（韓國現代微系統公司）過濾，將每種植物來源的外泌體制備物按1：1：1比例混合進行後續實驗。 製備的外泌體樣品儲存在-80C直至使用。
2.2 細胞培養
為評估外泌體的作用，我們使用了人角質形成細胞HaCaT細胞（Cell Line Service GmBH公司）。 細胞在含有10%胎牛血清（FBS）和青黴素-鏈黴素硫酸鹽（100單位/mL和100μg/mL）的杜爾貝科改良鷹培養基（DMEM）中培養，培養條件為37C、5% CO₂環境。 細胞維持在培養密度低於110⁵個細胞/mL的條件下。
2.3 細胞毒性實驗
將處於指數生長期的HaCaT細胞以110⁵個細胞/孔接種在96孔培養板中，並用不同劑量的外泌體（1至1000μg/mL）處理24小時。 然後使用MTS試劑（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-5-（3-羧基甲氧基苯基）-2-（4-磺基苯基）-2H-四唑內鹽）（Promega公司）評估細胞。 向每孔加入10μL MTS溶液，細胞額外培養4小時。 使用微孔板分光光度計（Multiskan Go，Thermo Scientific公司）測量490 nm處的光密度。 對照細胞被認為100%存活。 我們選擇了較低的外泌體實驗劑量。
2.4 ELISA生物標誌物分析
將HaCaT細胞以510⁵個細胞/mL的密度接種到6孔板中並培養。 更換含各種濃度測試樣品的新鮮培養基后，將細胞培養24小時。 收集的上清液用於評估皮膚保濕功效。 使用ELISA試劑盒（R&
Systems公司）定量炎症細胞因數IL-6。 使用ELISA試劑盒定量保濕活性的生物標誌物，包括I型前膠原（Abcam公司）、基質金屬蛋白酶（MMP）-1（Abcam公司）、透明質酸（R& Systems公司）、膠原酶（Invitrogen公司）和彈性蛋白酶（Invitrogen公司）。2.5 西部印跡分析
獲取培養細胞的全細胞裂解物，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，並進行西部印跡分析。 我們從Abcam公司購買了包括抗ASAH1、抗SHMT1、抗SPTLC1、抗包殼蛋白、抗PPAR-α、抗彈性蛋白和抗HAS-2在內的主要抗體。 抗絲聚蛋白（Thermo Fisher Scientific公司）、抗HAS-3（Santa Cruz公司）和抗p53、抗COL-1（Cell Signaling Technology公司）抗體分別從相應公司購買。
2.6 透射電子顯微鏡分析
使用透射電子顯微鏡（TEM; H-7600，日立公司）在80 kV加速電壓下檢查樣品的形態特徵。 對於TEM製備，將10μL顆粒懸浮液置於formvar/carbon塗層銅網上，吸附約1分鐘。 用濾紙去除多餘液體后，網格用2%（w/v）醋酸鈾負染30秒。 染色后的網格在室溫下完全乾燥，隨後在各種放大倍數下成像以評估顆粒大小和形態。
2.7 奈米顆粒追蹤分析
使用納米顆粒追蹤分析系統（NTA; ZetaView PMX-120，Particle Metrix公司）確定顆粒大小分佈和濃度。 測量前，每種樣品用三蒸水稀釋以獲得適當的顆粒濃度進行分析。 將稀釋后的懸浮液引入儀器，在相同的相機設置下，在11個預定義位置記錄視頻，進行三次連續掃描迴圈。 相機靈敏度設置為85，快門速度固定為100。 使用ZetaView軟體（版本8.05.16 SP7）處理所有記錄的視頻，計算平均顆粒大小、尺寸分佈和顆粒濃度。
2.8 LC-MS/MS脂質譜分析
對於脂質提取，將50μL PBS和50μL脂質標準溶液添加到沉澱樣品中，然後在冰浴中進行尖端超聲處理1分鐘（振幅10%，脈衝開啟：0.5秒，脈衝關閉：0.5秒）。 然後，加入250μL甲醇（MeOH）和1 mL甲基叔丁基醚（MTBE），使用旋轉器渦旋1小時。 加入200μL H₂O后，樣品再次在旋轉器上渦旋10分鐘。 通過在3000g下離心5分鐘實現相分離，將上層轉移到新的Eppendorf管中。 為提取殘留脂質，向剩餘沉澱中加入400μL MTBE，渦旋10分鐘，再次在3000g下離心5分鐘。 將所得上層與先前收集的上清液合併。 將合併的提取物在SpeedVac中完全乾燥過夜，並重新溶解在100μL MeOH：CHCl₃（9：1，v/v）中。 將每種樣品的4μL等分試樣注入UPLC系統的分析柱中。 使用溶劑B（有機相）的線性梯度在30分鐘內分離樣品，流速為0.25 mL/min。 每個樣品分析三次。 使用LipidSearch 4.2.21版進行脂質鑒定。 為確保準確的脂質譜，手動過濾結果中的假陽性峰。
2.9 統計分析
數據表示為均值標準差（SD），所有統計分析均使用Sigmaplot v14.0軟體（Systat Software公司）進行。 通過單向方差分析（ANOVA）和Duncan多重比較檢驗進行統計分析。 p值<0.05被認為具有顯著性。
3. 結果
3.1 透射電子顯微鏡和納米顆粒追蹤分析對植物來源外泌體的表徵
使用透射電子顯微鏡（TEM）和納米顆粒追蹤分析（NTA）分析了從紫薇（Lagerstroemia indica）花朵、花椒（Zanthoxylum piperitum）果實和紅松（Pinus densiflora）葉子中提取的外泌體提取物的形態和物理特性。 如圖1所示，TEM圖像顯示分離的囊泡表現出典型的杯狀或球形形態，具有完整的脂質雙層膜，與外泌體已知的結構特徵一致。 未觀察到明顯的碎屑或聚集，表明分離和純化過程成功地產生了均勻的囊泡群體。 NTA測量進一步證實了外泌體制備物的納米級尺寸分佈。 顆粒濃度和分佈譜顯示所有三種植物來源之間具有高度一致性，表明外泌體穩定產生且在物理化學性質上具有可比性。 這些結果與TEM和NTA分析一起證實，從紅松、花椒和紫薇中提取的外泌體已成功分離和純化，表現出均勻的形態和納米級尺寸，從而為後續生物學和功能測定提供了特徵明確的囊泡。
3.2 外泌體提取物對人細胞系的毒性
首先，我們通過MTS實驗確定了外泌體對人角質形成細胞HaCaT細胞的潛在毒性。 本研究使用HaCaT角質形成細胞，因為它們作為一種廣泛使用的表皮細胞模型，保留了原代角質形成細胞的基本功能特徵，如分化潛力和對內外部及炎症線索的敏感性。 由於我們研究的重點是表皮屏障完整性和角質形成細胞驅動的炎症事件，該細胞系提供了合適的實驗系統。 相比之下，真皮成纖維細胞主要參與細胞外基質產生和真皮修復過程，因此更適用於以真皮重塑而非表皮生理為中心的研究。 儘管基於成纖維細胞的實驗可以補充我們的發現，但HaCaT細胞是解決本研究中檢查的表皮方面的最合適模型。 圖2所示的結果清楚地表明，外泌體提取物在處理的濃度範圍內未引起細胞毒性。
3.3 外泌體提取物對人細胞系中IL-6水準的抑製作用
為檢驗植物來源外泌體提取物的抗炎作用，在用TNF-α和IFN-γ（各10 ng/mL）刺激后，評估了HaCaT細胞中IL-6的分泌。 如圖3所示，與未處理的對照組相比，細胞因數刺激組的IL-6水平顯著增加，確認了炎症反應的成功誘導。 外泌體提取物處理以劑量依賴性方式顯著降低了IL-6的分泌，表明這些囊泡能有效減輕角質形成細胞中細胞因數誘導的炎症。 在測試條件下，與水提取物處理組（ZLPW組）相比，外泌體處理組顯示出對IL-6表達的明顯更強的抑製作用。 這些發現表明，紅松、花椒和紫薇來源的外泌體通過調節促炎細胞因數的產生，發揮強大的抗炎活性，從而有助於在炎症壓力條件下維持皮膚屏障穩態。
3.4 外泌體提取物在人細胞系中的皮膚屏障增強功能
為進一步闡明植物來源外泌體提取物皮膚屏障增強作用的機制，通過西部印跡分析了TNF-α/IFN-γ刺激的HaCaT細胞中關鍵屏障相關蛋白的表達。 如圖4和圖S1所示，與未處理對照組相比，TNF-α/IFN-γ刺激顯著改變了幾種脂質代謝和神經醯胺合成相關酶的表達，包括ASAH1、SHMT1和SPTLC1。 外泌體提取物處理有效地逆轉了這些變化，顯著恢復了SHMT1和SPTLC1的表達，同時降低了在炎症條件下異常升高的ASAH1水準。 這些結果表明，外泌體提取物有助於正常化脂質代謝和神經醯胺生物合成，從而支持皮膚屏障恢復。 此外，我們檢查了結構和分化相關蛋白的表達，包括包殼蛋白、絲聚蛋白和過氧化物酶體增殖物激活受體α（PPAR-α），它們在維持表皮完整性方面發揮關鍵作用（圖5和圖S1）。 結果表明，TNF-α/IFN-γ刺激顯著降低了這些蛋白的表達，而外泌體提取物處理以劑量依賴性方式顯著恢復了它們的水準。 與水提取物處理組（ZLPW）相比，外泌體處理的細胞顯示出這些屏障相關蛋白的更高上調。
綜合來看，這些結果表明，紅松、花椒和紫薇植物來源的外泌體提取物通過調節脂質代謝相關酶和對表皮分化和功能至關重要的結構蛋白，促進皮膚屏障修復。
3.5 外泌體提取物對MMP-1分泌和I型前膠原降解的抑製作用
I型前膠原是在真皮成纖維細胞中合成的I型膠原的前體。 為研究植物來源外泌體提取物是否影響細胞外基質維持和膠原代謝，在用不同濃度的外泌體（0.1、0.5和1μg/mL）處理后，測量了HaCaT細胞中MMP-1分泌和I型前膠原水準。 如圖6A所示，與未處理對照組相比，TNF-α/IFN-γ刺激顯著增加了MMP-1分泌，表明在炎症條件下基質降解。 外泌體提取物處理以濃度依賴性方式顯著降低了MMP-1水準，表明這些囊泡對細胞外基質降解具有保護作用。 相比之下，I型前膠原的產生在處理後顯著增強（圖6B）。 前膠原水準的增加表明外泌體促進了膠原合成並可能改善了真皮基質重塑。 此外，與植物水提取物處理組（ZLPW組）相比，外泌體處理組顯示出更明顯的效果，暗示外泌體制劑具有更高的生物活性和遞送效率。 這些結果表明，紅松、花椒和紫薇植物來源的外泌體提取物能有效保護皮膚細胞免受基質降解，同時刺激膠原合成，對皮膚具有抗衰老和保濕作用。
3.6 紅松、花椒和紫薇植物來源外泌體提取物對HaCaT細胞保濕活性的影響
為研究紅松、花椒和紫薇植物來源外泌體提取物的保濕和抗衰老作用，我們檢查了它們抑制細胞外基質降解酶和增強HaCaT細胞中關鍵皮膚保濕標誌物的能力。 如圖7所示，與未處理對照組相比，植物來源的外泌體提取物處理顯著抑制了膠原酶（圖7A）和彈性蛋白酶（圖7B）的活性，且呈濃度依賴性。 這種抑製作用表明外泌體通過防止膠原和彈性蛋白降解有效保護細胞外基質，從而有助於維持皮膚彈性和抗衰老潛力。 此外，外泌體處理顯著增加了透明質酸（HA）的產生（圖7C），透明質酸是維持皮膚水分的關鍵潤濕劑。 這些結果表明，外泌體提取物通過酶抑制和刺激保濕因數，增強了皮膚的保水能力。 此外，西部印跡分析證實，與對照組相比，外泌體處理的細胞中I型膠原（COL-1）、彈性蛋白、透明質酸合酶-2（HAS-2）和HAS-3的表達水準顯著上調（圖7D-G和圖S1）。 此外，外泌體處理后，凋亡和細胞衰老的關鍵調節因數p53的表達顯著降低（圖7F，G和圖S1）。 綜合來看，這些發現表明，從三種植物物種提取的外泌體提取物通過增強細胞外基質合成和皮膚保濕，同時減弱凋亡和衰老相關通路並抑制細胞外基質降解，發揮強大的保濕和抗衰老作用。
4. 討論
本研究表明，從紅松、花椒和紫薇中獲得的外泌體提取物對皮膚保濕和屏障強化具有多種積極作用。 組合外泌體制備物減輕了TNF-α/IFN-γ誘導的炎症，並促進了對表皮平衡至關重要的關鍵結構蛋白和脂質代謝調節因數的表達。 總體而言，這些結果表明植物來源的外泌體作為天然生物載體，通過協同抗炎和再生作用恢復受損皮膚。
在HaCaT細胞中檢測到的IL-6分泌減少表明外泌體提取物調節細胞因數依賴性炎症通路。 由於IL-6是一種主要的炎症介質，已知會削弱緊密連接並加劇屏障損傷，其下調表明這些囊泡可能有助於在炎症條件下維持表皮穩定性。 這種免疫調節作用與早期發現一致，即植物來源的細胞外囊泡可以調節MAPK和NF-κB信號通路，導致促炎細胞因數產生減少。
同樣，ASAH1、SHMT1和SPTLC1表達的增加表明外泌體提取物有助於維持角質層結構完整性和滲透控制的脂質重塑和神經醯胺合成過程。 包殼蛋白、絲聚蛋白和PPAR-α表達的恢復進一步表明表皮分化和脂質屏障形成得到改善。 這些發現共同表明，外泌體處理加強了屏障結構，提供了超越單純炎症抑制的持續支援。 此外，外泌體提取物通過促進I型前膠原和透明質酸的合成，同時抑制MMP-1、膠原酶和彈性蛋白酶的活性，增強了細胞外基質組織和保濕。 這些結果表明外泌體有助於防止細胞外基質降解並增強真皮彈性，這與它們富含磷脂醯乙醇胺（PE）、磷脂醯肌醇（PI）和神經醯胺類別的脂質組成一致，如表1所示。 表1總結了ZPLE樣品中平均峰面積最高的30種脂質，表2總結了主要脂質類別和類別的分類。 通過將每種脂質的平均MS1峰面積除以每個樣品中檢測到的所有脂質的平均MS1峰面積之和，並將值表示為百分比，計算每種脂質的相對豐度。 在樣品中，PE和PI按順序檢測到的比例最高。 這些脂質以其促進囊泡和細胞膜融合以及調節與皮膚保濕相關的信號通路而聞名。
觀察到的廣泛功效可能源於從三種植物來源的外泌體中封裝的獨特代謝物組合。 紅松富含萜烯和多酚，花椒含有具有抗炎潛力的生物鹼和黃酮類化合物，紫薇提供具有強抗氧化特性的三萜和花青素。 這些生物活性化合物的組合可能產生協同效應，與來自單一植物來源的外泌體相比，提高了外泌體的穩定性和功能活性。
綜上所述，這些結果表明植物來源的外泌體可以作為用於皮膚健康的合成納米顆粒的環保、生物相容性替代品。 通過同時體愛飛機杯陰蒂高潮液陰莖增大藥陰莖增大膏陰莖增大器速效雙效藥速效持久藥速效勃起藥迷情型藥費洛蒙香水聽話型乖乖水男性用藥男性外抹藥淫汁水昏睡藥持久延時液女性春藥女性外塗失憶型藥增慾按摩油增慾催情藥口交潤滑液印度神油液催情藥保養增強藥乳頭刺激液
靶向炎症、脂質代謝和細胞外基質合成，它們可能提供針對環境壓力和衰老的全面保護。 然而，需要進一步研究來闡明涉及的精確分子通路，確認體內外囊泡攝取機制，並評估化妝品應用中的配方穩定性。
5. 結論
從花椒、紫薇和紅松中獲得的外泌體提取物被發現通過減輕炎症並恢復TNF-α/IFN-γ刺激的HaCaT細胞中關鍵屏障相關蛋白的表達，加強皮膚屏障功能。 值得注意的是，包括包殼蛋白、絲聚蛋白、PPAR-α、SHMT1和SPTLC1在內的必需結構和調節蛋白的水準得到恢復，導致表皮分化、脂質代謝和神經醯胺產生增強。 此外，這些提取物通過刺激前膠原和透明質酸的合成，抑制MMP-1表達，並促進膠原酶和彈性蛋白酶抑制，展示了顯著的保濕效果。 綜合來看，這些發現表明植物來源的外泌體作為化妝品成分具有強化皮膚屏障完整性和維持水分的強大力量。 它們在恢復皮膚結構和維持水分平衡方面的雙重功能突顯了它們在下一代護膚配方中的潛力，值得進一步研究作為功能性化妝品中的活性成分進行開發。
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