GFHDT: 人類血液外泌體：分離與表徵方法、變異性及標準化方案需求綜述
人類血液外泌體：分離與表徵方法、變異性及標準化方案需求綜述
15 Mar 2026 at 02:16am
背景/目的：作為生物活性細胞外囊泡，外泌體參與細胞通訊和疾病機制，但其結構複雜性持續挑戰標準分析方法。 本綜述總結了報告健康個體血漿、血清和富血小板血漿中外泌體濃度的已發表研究，並強調方法學差異。方法：通過PubMed資料庫進行全面檢索（1986年-2025年8月31日），使用與外泌體及其定量相關的術語，排除癌症和疾病相關研究。 符合條件的文章使用粒子計數技術（如納米粒子追蹤分析、流式細胞術或可調電阻脈衝感感）報告血漿、血清或富血小板血漿中外泌體濃度。結果：22篇文章（含167名健康供體）符合納入標準。 報告的平均濃度範圍如下：血漿（n=18），4.5010^8至6.7010^11 particles/mL，不同定量方法存在差異; 血清（n=10），5.3010^8至2.1310^11 particles/mL; 非啟動富血小板血漿（n=1），7.5210^9 particles/mL; 啟動富血小板血漿（n=3），4.8710^10至7.1610^10 particles/mL; 經光熱生物調節預處理的富血小板血漿（n=2），2.5310^11至2.9910^11 particles/mL。結論：分離和定量方法表現出高度變異性，強烈影響外泌體總體數量和品質。 開發驗證方法時必須考慮貨物組成、純度和外泌體完整性等特性。 新興證據表明光熱生物調節預處理可增加細胞外泌體釋放。 嚴格標準化方案對推進外泌體療法的科學理解和臨床潛力至關重要。
關鍵詞：外泌體; 細胞外囊泡; 定量; 分離方法; 富血小板血漿; 光熱生物調節
1. 引言
細胞外囊泡（EVs）是大小在30至2000納米之間的球形磷脂雙層結構。 幾乎所有細胞類型都分泌EVs，它們存在於大多數生物流體中，包括血液、尿液、唾液、母乳、支氣管灌洗液、腦脊液和羊水。 根據大小、來源、組成和功能，EVs可分為外泌體、微囊泡（MVs）和凋亡小體。 外泌體參與正常生物功能和疾病過程，直接促進細胞通訊、免疫反應和腫瘤擴散。
外泌體含有生物活性物質，包括蛋白質、脂質和遺傳資訊，如mRNA和非編碼核糖核酸（RNAs），包括微RNA（miRNAs），其外層還顯示額外的蛋白質。 生物發生和外泌體遞送的過程發生在多泡體與質膜融合時。 然而，這一過程背後的分子機制仍不清楚。 外泌體釋放受多種物理和化學因素以及細胞條件的影響，包括脂多糖、腫瘤壞死因數-α、干擾素-γ、低氧水準、鈣、化療藥物暴露、溫度和氧化應激。
1.1 外泌體臨床應用
由於其生物相容性、低免疫原性和能夠穿越血腦屏障，外泌體在臨床應用方面引起廣泛關注。 研究的主要領域之一是再生醫學，在組織修復和再生方面取得有希望的結果，包括癌症、骨科、肺再生醫學、眼科、毛髮再生和腦部疾病領域。 外泌體在癌症、心血管、神經、自身免疫和傳染病的診斷和預後方面也具有潛力，通過微創程序實現。 此外，它們能夠遞送特定生物標誌物貨物和調節免疫反應，使其成為潛在治療劑。 外泌體可將靶向治療遞送到特定細胞或組織，克服傳統遞送方法的局限性。 例如，它們正被探索用於開發基於外泌體的疫苗。
儘管取得進展，仍存在若干挑戰。 關鍵問題包括優化分離和純化方法，以及關於外泌體貨物穩定性和生物利用度的擔憂。 此外，與基於外泌體的診斷和治療相關的監管環境仍在發展中。
鑒於這些考慮，準確檢測和定量至關重要。 然而，其大女士催情藥延時噴霧劑性用品周邊治療性冷感淫蕩春藥水男士催情藥男士助勃藥男士持久藥補腎壯陽藥迷昏失憶型陰莖增大丸
小和結構的複雜性即使對黃金標準方法也構成挑戰。 分離和RNA純化技術的變異性常導致不一致數據，阻礙研究結果可比性。
1.2 外泌體分離方法
當前外泌體分離方法包括超速離心（UC）、超濾（UF）、沉澱、基於免疫親和的捕獲（IAC）和微流體技術。
超速離心（UC）：UC通過順序離心，基於大小和密度從生物樣本中分離外泌體。 初始低速旋轉去除細胞和碎片，隨後超速離心（>100,000 g）沉澱外泌體用於進一步分析。
超濾（UF）：UF使用具有定義孔徑的膜基於大小分離外泌體。 通常，較大孔徑去除碎片，而較小孔徑（50-200納米）保留外泌體並排除較小分子。
沉澱：該技術使用聚合物（如聚乙二醇）降低外泌體溶解度，誘導聚集。 在4C下孵育后，通過低速離心收集外泌體。
基於免疫親和的捕獲（IAC）：IAC使用針對特定外泌體表面蛋白的抗體，能夠選擇性、高純度地分離細胞類型特異性亞群，包括腫瘤來源的外泌體。
微流體技術：這些方法基於大小、親和力或兩者組合分離外泌體。 基於大小的分離包括微過濾技術，使用微孔將較大顆粒與外泌體分離; 尺寸排阻色譜，通過微流體通道分離外泌體; 以及粘彈性，利用流體彈性特性分離顆粒，將較大碎片推離外泌體。
1.3 外泌體定量方法
外泌體快速高效定量的主要方法包括納米粒子追蹤分析（NTA）、流式細胞術（FCM）、可調電阻脈衝感感（TRPS）、電子顯微鏡、動態光散射（DLS）、基於微流體的檢測、表面等離子共振（SPR）和單粒子干涉反射成像感測器（SP-IRIS）。
納米粒子追蹤分析（NTA）：NTA通過追蹤鐳射照射液體樣本中外泌體的布朗運動來量化外泌體。 記錄散射光，軟體根據單個軌跡計算粒子大小和濃度。
流式細胞術（FCM）：FCM使用專門的流式細胞儀分析螢游標記的外泌體和微囊泡，實現多參數檢測和定量。
可調電阻脈衝感感（TRPS）：TRPS測量單個外泌體通過納米孔時電阻的變化，確定粒子大小、濃度和電荷。
電子顯微鏡（EM）：特別是透射電子顯微鏡提供高解析度圖像以計數單個囊泡並評估其形態。 TEM確認樣本純度和結構完整性，通常與其他技術結合使用。
動態光散射（DLS）:D LS通過用鐳射照射樣本並測量由囊泡布朗運動引起的散射光波動來量化外泌體。
基於微流體的檢測：微流體設備使用集成的晶元上分析從少量液體樣本中分離和分析外泌體。 分離可使用尺寸排阻色譜、免疫親和或介電泳進行，實現對30-150納米囊泡的選擇性檢測。
表面等離子共振（SPR）：SPR通過檢測當外泌體結合固定化抗體時折射率的變化來量化外泌體。
單粒子干涉反射成像感測器（SP-IRIS）：SP-IRIS使用帶有功能化抗體的特殊晶元從流體樣本中捕獲單個囊泡來量化外泌體。
在選擇外泌體分離或定量方法時，必須考慮成本、所需時間和每種方法的特定優缺點。 例如，某些方法可能在其計數中包括非外泌體粒子，影響結果準確性。
表1. 外泌體分離和定量技術的潛在缺點，包括獲得的粒子數量、完整性和特異性。
分離方法
缺點
超速離心（UC）
高速可損傷外泌體。 UC可導致機械損傷，難以維持外泌體的生物活性和形態完整性。
超濾（UF）
外泌體純度中等。 外泌體可能因膜損傷而丟失，損害其與靶細胞結合和通訊的能力。
沉澱
與非外泌體污染物（包括蛋白質和聚合材料）共同沉澱。 常見污染物包括殘留蛋白質、脂質和聚合物，可能保留生物活性，導致關於外泌體介導過程的錯誤結論。
基於免疫親和的捕獲（IAC）
IAC可能損害外泌體的功能能力。
微流體技術
由於生物樣本複雜性、外泌體與其他EVs的尺寸重疊以及外泌體異質性，該方法敏感性較低且分離的外泌體純度較低。
定量方法
缺點
---------
------
納米粒子追蹤分析（NTA）
該方法也測量非外泌體污染物。 NTA無法區分EVs與其他粒子（如脂蛋白）。
流式細胞術（FCM）
當樣本中較小囊泡濃度高且散射或螢光信號超過檢測限時，較小囊泡被計為單個粒子。
可調電阻脈衝感測（TRPS）
對較小外泌體不敏感，較小囊泡被計為單個粒子。
動態光散射（DLS）
該技術無法分析異質性外泌體群體。
表面等離子共振（SPR）
難以區分特異性和非特異性相互作用，存在品質敏感性和感測器區域限制。
單粒子干涉反射成像感測器（SP-IRIS）
CD81的檢測限為3.9410^9，CD63為5.0710^9 particles/mL。
除了外泌體的自然生物發生外，還研究香港龍城大藥房全部商品香港龍城大藥房必買商品香港龍城中西大藥房香港龍城藥房線上訂購香港龍城暢銷商品關於香港龍城大藥房香港龍城大藥房獨家資訊香港龍城大藥房折扣香港龍城大藥房配送方式
了改變其產生的不同方法。 這些方法基於電刺激、藥理劑、電磁波、聲波、剪切應力、細胞饑餓、酒精、pH值、熱量和基因操作。 然而，這些策略中的許多可能改變外泌體特性和功能性，且導致這種增加的確切機制通常未知。 提高外泌體生產和生物功能對促進其臨床應用至關重要。
鑒於健康個體人類血漿、血清和富血小板血漿中外泌體濃度報告的變異性，本綜述旨在總結可用數據並突出方法學差異，這些差異突顯了標準化操作程式和準確協定的必要性。
2. 材料與方法
文獻搜索在PubMed資料庫中進行，涵蓋從1986年（人類外泌體第一篇文章發表年份）到2025年8月31日的研究。 搜索查詢包括「外泌體」或「細胞外囊泡」等關鍵詞，與「粒子」或“particles/mL”（以識別定量數據）以及「濃度」或「定量」和樣本類型描述符（“血漿”，包括富血小板血漿，或“血清”）組合。 為專注於健康供體，排除了與「癌症」或「轉移」等相關記錄。 納入標準限於來自健康供體的人類樣本數據，血漿、血清或PRP中外泌體定量，以particles/mL表示。
3. 結果
“外泌體”或“細胞外囊泡”的搜索產生35,044篇文章。 在將“血清”、“血漿”或“富血小板血漿”、“濃度”或“定量”以及“粒子”或“particles/mL”的搜尋結果與“外泌體”或“細胞外囊泡”的搜索交叉後，共獲得126篇文章。 在直接Google搜索中，包含三篇文章。 拿掉超出範圍標題的文章后，選擇84篇文章進行最終審查。 深入分析正文後，選擇22篇文章，涉及約167名健康供體，其中18篇文章中有29次血漿中外泌體定量，4篇文章中有10次血清中，1篇文章中有1次非啟動PRP中，1篇文章中有3次用不同啟動劑啟動的PRP中（葡萄糖酸鈣、凝血酶和凝血酶加葡萄糖酸鈣），以及2次預處理PRP中（藍光467納米，1.0 J/cm，37C; 以及藍光467奈米，2.0 J/cm，37C）。
血漿中外泌體的平均濃度範圍為4.5010^8至6.7010^11 particles/mL。 按定量方法分層，平均濃度範圍為FCM的3.5010^6至1.5010^10 particles/mL，NTA的4.5010^8至6.7010^11 particles/mL，以及TRPS的9.0510^8至4.3610^10 particles/mL。 血清中通過NTA評估的平均外泌體濃度範圍為5.3010^8至2.1310^11 particles/mL。 非啟動PRP的納米流分析外泌體平均濃度為7.5210^9 particles/mL。 啟動PRP樣本（包括所有啟動方法）的外泌體平均值範圍為4.8710^10至7.1610^10 particles/mL，預處理PRP為2.5310^11至2.9910^11 particles/mL; 所有評估均通過NTA進行。
關鍵詞：外泌體; 細胞外囊泡; 定量; 分離方法; 富血小板血漿; 光熱生物調節
1. 引言
細胞外囊泡（EVs）是大小在30至2000納米之間的球形磷脂雙層結構。 幾乎所有細胞類型都分泌EVs，它們存在於大多數生物流體中，包括血液、尿液、唾液、母乳、支氣管灌洗液、腦脊液和羊水。 根據大小、來源、組成和功能，EVs可分為外泌體、微囊泡（MVs）和凋亡小體。 外泌體參與正常生物功能和疾病過程，直接促進細胞通訊、免疫反應和腫瘤擴散。
外泌體含有生物活性物質，包括蛋白質、脂質和遺傳資訊，如mRNA和非編碼核糖核酸（RNAs），包括微RNA（miRNAs），其外層還顯示額外的蛋白質。 生物發生和外泌體遞送的過程發生在多泡體與質膜融合時。 然而，這一過程背後的分子機制仍不清楚。 外泌體釋放受多種物理和化學因素以及細胞條件的影響，包括脂多糖、腫瘤壞死因數-α、干擾素-γ、低氧水準、鈣、化療藥物暴露、溫度和氧化應激。
1.1 外泌體臨床應用
由於其生物相容性、低免疫原性和能夠穿越血腦屏障，外泌體在臨床應用方面引起廣泛關注。 研究的主要領域之一是再生醫學，在組織修復和再生方面取得有希望的結果，包括癌症、骨科、肺再生醫學、眼科、毛髮再生和腦部疾病領域。 外泌體在癌症、心血管、神經、自身免疫和傳染病的診斷和預後方面也具有潛力，通過微創程序實現。 此外，它們能夠遞送特定生物標誌物貨物和調節免疫反應，使其成為潛在治療劑。 外泌體可將靶向治療遞送到特定細胞或組織，克服傳統遞送方法的局限性。 例如，它們正被探索用於開發基於外泌體的疫苗。
儘管取得進展，仍存在若干挑戰。 關鍵問題包括優化分離和純化方法，以及關於外泌體貨物穩定性和生物利用度的擔憂。 此外，與基於外泌體的診斷和治療相關的監管環境仍在發展中。
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1.2 外泌體分離方法
當前外泌體分離方法包括超速離心（UC）、超濾（UF）、沉澱、基於免疫親和的捕獲（IAC）和微流體技術。
超速離心（UC）：UC通過順序離心，基於大小和密度從生物樣本中分離外泌體。 初始低速旋轉去除細胞和碎片，隨後超速離心（>100,000 g）沉澱外泌體用於進一步分析。
超濾（UF）：UF使用具有定義孔徑的膜基於大小分離外泌體。 通常，較大孔徑去除碎片，而較小孔徑（50-200納米）保留外泌體並排除較小分子。
沉澱：該技術使用聚合物（如聚乙二醇）降低外泌體溶解度，誘導聚集。 在4C下孵育后，通過低速離心收集外泌體。
基於免疫親和的捕獲（IAC）：IAC使用針對特定外泌體表面蛋白的抗體，能夠選擇性、高純度地分離細胞類型特異性亞群，包括腫瘤來源的外泌體。
微流體技術：這些方法基於大小、親和力或兩者組合分離外泌體。 基於大小的分離包括微過濾技術，使用微孔將較大顆粒與外泌體分離; 尺寸排阻色譜，通過微流體通道分離外泌體; 以及粘彈性，利用流體彈性特性分離顆粒，將較大碎片推離外泌體。
1.3 外泌體定量方法
外泌體快速高效定量的主要方法包括納米粒子追蹤分析（NTA）、流式細胞術（FCM）、可調電阻脈衝感感（TRPS）、電子顯微鏡、動態光散射（DLS）、基於微流體的檢測、表面等離子共振（SPR）和單粒子干涉反射成像感測器（SP-IRIS）。
納米粒子追蹤分析（NTA）：NTA通過追蹤鐳射照射液體樣本中外泌體的布朗運動來量化外泌體。 記錄散射光，軟體根據單個軌跡計算粒子大小和濃度。
流式細胞術（FCM）：FCM使用專門的流式細胞儀分析螢游標記的外泌體和微囊泡，實現多參數檢測和定量。
可調電阻脈衝感感（TRPS）：TRPS測量單個外泌體通過納米孔時電阻的變化，確定粒子大小、濃度和電荷。
電子顯微鏡（EM）：特別是透射電子顯微鏡提供高解析度圖像以計數單個囊泡並評估其形態。 TEM確認樣本純度和結構完整性，通常與其他技術結合使用。
動態光散射（DLS）:D LS通過用鐳射照射樣本並測量由囊泡布朗運動引起的散射光波動來量化外泌體。
基於微流體的檢測：微流體設備使用集成的晶元上分析從少量液體樣本中分離和分析外泌體。 分離可使用尺寸排阻色譜、免疫親和或介電泳進行，實現對30-150納米囊泡的選擇性檢測。
表面等離子共振（SPR）：SPR通過檢測當外泌體結合固定化抗體時折射率的變化來量化外泌體。
單粒子干涉反射成像感測器（SP-IRIS）：SP-IRIS使用帶有功能化抗體的特殊晶元從流體樣本中捕獲單個囊泡來量化外泌體。
在選擇外泌體分離或定量方法時，必須考慮成本、所需時間和每種方法的特定優缺點。 例如，某些方法可能在其計數中包括非外泌體粒子，影響結果準確性。
表1. 外泌體分離和定量技術的潛在缺點，包括獲得的粒子數量、完整性和特異性。
分離方法
缺點
超速離心（UC）
高速可損傷外泌體。 UC可導致機械損傷，難以維持外泌體的生物活性和形態完整性。
超濾（UF）
外泌體純度中等。 外泌體可能因膜損傷而丟失，損害其與靶細胞結合和通訊的能力。
沉澱
與非外泌體污染物（包括蛋白質和聚合材料）共同沉澱。 常見污染物包括殘留蛋白質、脂質和聚合物，可能保留生物活性，導致關於外泌體介導過程的錯誤結論。
基於免疫親和的捕獲（IAC）
IAC可能損害外泌體的功能能力。
微流體技術
由於生物樣本複雜性、外泌體與其他EVs的尺寸重疊以及外泌體異質性，該方法敏感性較低且分離的外泌體純度較低。
定量方法
缺點
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納米粒子追蹤分析（NTA）
該方法也測量非外泌體污染物。 NTA無法區分EVs與其他粒子（如脂蛋白）。
流式細胞術（FCM）
當樣本中較小囊泡濃度高且散射或螢光信號超過檢測限時，較小囊泡被計為單個粒子。
可調電阻脈衝感測（TRPS）
對較小外泌體不敏感，較小囊泡被計為單個粒子。
動態光散射（DLS）
該技術無法分析異質性外泌體群體。
表面等離子共振（SPR）
難以區分特異性和非特異性相互作用，存在品質敏感性和感測器區域限制。
單粒子干涉反射成像感測器（SP-IRIS）
CD81的檢測限為3.9410^9，CD63為5.0710^9 particles/mL。
除了外泌體的自然生物發生外，還研究香港龍城大藥房全部商品香港龍城大藥房必買商品香港龍城中西大藥房香港龍城藥房線上訂購香港龍城暢銷商品關於香港龍城大藥房香港龍城大藥房獨家資訊香港龍城大藥房折扣香港龍城大藥房配送方式
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鑒於健康個體人類血漿、血清和富血小板血漿中外泌體濃度報告的變異性，本綜述旨在總結可用數據並突出方法學差異，這些差異突顯了標準化操作程式和準確協定的必要性。
2. 材料與方法
文獻搜索在PubMed資料庫中進行，涵蓋從1986年（人類外泌體第一篇文章發表年份）到2025年8月31日的研究。 搜索查詢包括「外泌體」或「細胞外囊泡」等關鍵詞，與「粒子」或“particles/mL”（以識別定量數據）以及「濃度」或「定量」和樣本類型描述符（“血漿”，包括富血小板血漿，或“血清”）組合。 為專注於健康供體，排除了與「癌症」或「轉移」等相關記錄。 納入標準限於來自健康供體的人類樣本數據，血漿、血清或PRP中外泌體定量，以particles/mL表示。
3. 結果
“外泌體”或“細胞外囊泡”的搜索產生35,044篇文章。 在將“血清”、“血漿”或“富血小板血漿”、“濃度”或“定量”以及“粒子”或“particles/mL”的搜尋結果與“外泌體”或“細胞外囊泡”的搜索交叉後，共獲得126篇文章。 在直接Google搜索中，包含三篇文章。 拿掉超出範圍標題的文章后，選擇84篇文章進行最終審查。 深入分析正文後，選擇22篇文章，涉及約167名健康供體，其中18篇文章中有29次血漿中外泌體定量，4篇文章中有10次血清中，1篇文章中有1次非啟動PRP中，1篇文章中有3次用不同啟動劑啟動的PRP中（葡萄糖酸鈣、凝血酶和凝血酶加葡萄糖酸鈣），以及2次預處理PRP中（藍光467納米，1.0 J/cm，37C; 以及藍光467奈米，2.0 J/cm，37C）。
血漿中外泌體的平均濃度範圍為4.5010^8至6.7010^11 particles/mL。 按定量方法分層，平均濃度範圍為FCM的3.5010^6至1.5010^10 particles/mL，NTA的4.5010^8至6.7010^11 particles/mL，以及TRPS的9.0510^8至4.3610^10 particles/mL。 血清中通過NTA評估的平均外泌體濃度範圍為5.3010^8至2.1310^11 particles/mL。 非啟動PRP的納米流分析外泌體平均濃度為7.5210^9 particles/mL。 啟動PRP樣本（包括所有啟動方法）的外泌體平均值範圍為4.8710^10至7.1610^10 particles/mL，預處理PRP為2.5310^11至2.9910^11 particles/mL; 所有評估均通過NTA進行。
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