zxcvb: 年齡依賴性KAT7/HBO1活性降低通過促進免疫特性損害imMKCL血小板生成能力

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研究亮點

• 細胞增殖階段的細胞週期調控決定血小板生成能力

• KAT7抑制導致imMKCL中G0期停滯和免疫表型佔主導

• 免疫型巨核細胞的主導地位由cGAS-STING通路介導

• imMKCL釋放的促炎細胞因數可能抑制血小板生成

摘要

主細胞庫（MCB）系統對再生細胞治療至關重要。 我們已開發基於誘導多能幹細胞（iPSC）的永生化巨核細胞祖細胞系（imMKCLs）作為iPSC衍生血小板（iPSC-PLT）輸注的MCB。 然而，imMKCLs同時表現出血小板生成和免疫偏向特性，增強的免疫活性會損害血小板生產。 免疫特性與血小板生成效率之間的聯繫尚不清楚。 在此，我們證明處於G1和G2/M間期的增殖imMKCLs有助於血小板生成，而賴氨酸乙醯轉移酶7（KAT7）通過抑制免疫偏向佔主導來維持這些間期。 使用WM3835抑制KAT7會增加G0期細胞，模擬imMKCL老化，並誘導cGAS-STING啟動、染色質不穩定以及腫瘤壞死因數（TNF）-α、干擾素（IFN）-β和其他促炎細胞因數的分泌。 此外，TNF-α處理重現了KAT7缺失時觀察到的向G0期轉變。 這些發現確定KAT7是通過防止免疫偏向特性來調控imMKCL增殖的關鍵調節因數，突顯了其作為iPSC-PLT製造中品質控制標誌物的潛力。

關鍵詞

1. 細胞週期


2. 免疫型巨核細胞


3. 賴氨酸乙醯轉移酶7


4. cGAS-STING

引言

血小板（PLTs）通過巨核細胞（MKs）細胞質的各種脫落機制產生。 我們先前建立了使用永生化MK祖細胞系（imMKCLs）作為誘導多能幹細胞（iPSC）衍生血小板（iPSC-PLT）生產的主細胞庫（MCB）的體外PLT製造系統，並開發了依賴湍流的生物反應器。 imMKCLs在強力黴素存在下（Dox-ON）表現出持續增殖，並在培養基中強力黴素耗盡后（Dox-OFF）產生iPSC-PLTs。 這些技術進步的結合促成了首次人體臨床試驗iPLAT1，該試驗使用患者自體imMKCLs。 值得注意的是，當關注通過擴增能力估計的imMKCL品質與iPSC-PLT生成能力之間的關係時，我們注意到Dox-ON階段的快速增殖率與後續Dox-OFF階段的iPSC-PLT生成能力相關; 相反，緩慢的增殖率會減少PLT數量。 基於體內MK發育過程中出現免疫偏向亞群的新概念，我們最近發現imMKCL亞群同樣具有免疫偏向特性，最終影響iPSC-PLT的生成能力。 該亞群高表達免疫MK基因，如血小板因數4（也稱為趨化因數[C-X-C基序]配體4）、前血小板鹼性蛋白、白細胞介素-8和干擾素相關基因，這些都惡化了imMKCLs的整體MCB品質。 儘管它們很重要，但免疫偏向佔主導的分子機制以及imMKCLs內的免疫MK亞群如何影響iPSC-PLT生產中的品質控制在很大程度上仍未被探索。

賴氨酸乙醯轉移酶7（KAT7，也稱為HBO1和MYST2）是組蛋白乙醯轉移酶MYST家族的關鍵成員，對染色質修飾和基因調控至關重要。 它通過與MEAF6和支架蛋白形成複合物，使組蛋白H3在賴氨酸14和組蛋白H4在賴氨酸5、8和12處乙醯化。 這些染色質修飾對調控基因轉錄、DNA複製和DNA修復過程至關重要。 此外，通過乙醯化H3K14，KAT7促進H3周轉和CENP-A整合，從而拮抗Suv39h1介導的失活，並促進著絲粒組裝，以確保細胞分裂過程中的染色體準確分離和基因組穩定性。 在血液系統中，KAT7是造血幹細胞自我更新、T細胞擴增、胎兒肝臟紅細胞生成和髓系白血病細胞所必需的。 相比之下，在與早衰相關的常染色體隱性遺傳病Werner綜合征（WS）中，KAT7被報導可誘導間充質幹細胞的細胞衰老。 然而，KAT7在細胞衰老和增殖中的對立作用是否依賴於上下文，因細胞類型和生理條件而異，仍有爭議。

在此，我們試圖闡明imMKCLs中的細胞週期轉換狀態，發現KAT7在抑制imMKCLs的免疫偏向特性方面起著關鍵作用，這與細胞週期G1和G2/M期的保留有關，從而導致增強的PLT生產。

結果

細胞增殖階段的細胞周期間期與巨核細胞成熟階段血小板生成能力的關係

我們已證實Dox-ON階段的快速增殖率與後續Dox-OFF成熟階段的增強血小板生產密切相關，但細胞周期調控如何影響最終的血小板脫落事件一直不明。 為了深入瞭解這一點，我們準備了短期培養（ST-C）（少於1個月）和長期培養（LT-C）（超過4個月）的imMKCLs，並驗證了先前結果。 由於異常糖基化已被認為是巨核細胞和血小板老化的標誌，我們首先通過蓖麻凝集素I（RCA-1）凝集素染色確認LT-C imMKCLs具有老化巨核細胞的特徵。

與ST-C imMKCLs相比，LT-C imMKCLs表現出略微增大的細胞尺寸，增殖能力和血小板生成能力下降，這是由多倍體化和前血小板形成受損造成的。 接下來，我們使用FUCCI報告系統研究了細胞週期狀態對imMKCLs血小板生成能力的影響。 值得注意的是，ST-C imMKCLs主要處於G1或G2/M期，而LT-C imMKCLs主要處於G0期。 隨後，我們在Dox-ON條件下收集各細胞週期階段的細胞，並啟動Dox-OFF培養以誘導血小板生成。 總體而言，G2/M期的細胞對ST-C和LT-C imMKCLs的血小板生成貢獻最大。 相應地，G2/M期分選的imMKCLs中>8N多倍體細胞佔主導地位，而G0期分選的imMKCLs中為2N細胞。 值得注意的是，ST-C但非LT-C imMKCLs在G1期也對血小板生成有顯著貢獻，並表現出更高的倍性。

有趣的是，在分選後Dox-ON培養3天后，所有三種分選的ST-C imMKCLs都轉變為預分選模式，主要由G1期細胞組成，其次是G2M期。 相比之下，大多數G0期分選的LT-C imMKCLs保持在G0期，而其他兩個分選亞群中G0期細胞比例增加，高於ST-C imMKCLs。 我們進一步研究了分選后Dox-OFF培養期間的細胞周期狀態。 在成熟的Dox-OFF imMKCLs中，無論來源是ST-C還是LT-C，大多數G0期分選的細胞都保持在G0期。 同時，G1或G2/M期分選的群體保持或進展到G1、S和G2/M期，儘管更多的LT-C imMKCLs進入G0期。 這些發現共同表明，雖然老化imMKCLs中增殖率低和血小板生成能力下降可能歸因於G0細胞週期停滯，但年輕imMKCLs維持向G1或G2/M期的轉換以生成血小板。

LT-C imMKCLs中KAT7和H3K14ac水準降低

細胞週期停滯也是細胞衰老的指標。 此外，我們先前報導顯示，血小板生成能力低或中等的克隆表現出衰老特徵。 鑒於KAT7被建議作為細胞衰老的新調節因數，我們試圖檢查imMKCLs中KAT7水準是否與增殖率和後續血小板生產相關。 值得注意的是，蛋白質印跡分析顯示，LT-C imMKCLs和WS imMKCLs與ST-C imMK相比，KAT7和下游H3K14ac修飾水平均較低。 特別是，WS imMKCLs表現出降低的細胞分裂（增殖率），導致與ST-C imMKCLs相比血小板產量下降。 這些結果表明KAT7是imMKCL增殖的關鍵調節因數，年齡依賴性的KAT7水準可能影響細胞周期進展。

KAT7的藥理學抑制導致細胞週期停滯，損害imMKCL增殖和成熟

為了確定KAT7在imMKCLs中的作用，我們評估了KAT6/KAT7抑製劑WM3835和WM1119抑制H3K14乙醯化的能力。 WM3835（5 μM）與WM1119（5 μM）相比顯著降低了H3K14ac水準，並顯著降低了ST-C imMKCLs中的KAT7蛋白表達，支援其作為本研究中選擇性KAT7抑製劑的適用性。 在Dox-OFF階段第1-5天給予WM3835不會影響血小板生產，表明KAT7在成熟階段不起作用。 相比之下，在Dox-ON階段用WM3835預處理9天（而非3天或6天），隨後去除強力黴素並進行6天的血小板成熟，顯著降低了血小板產量。 使用FUCCI感測器，我們確認KAT7抑制增加了G0期細胞數量，同時減少了G1和G2/M期細胞。

為避免WM3835可能的脫靶效應，我們還使用短髮夾RNA（shRNA）介導的KAT7敲低進行了實驗，這顯著降低了KAT7 mRNA表達。 shKAT7 imMKCLs中的細胞增殖和血小板生成能力均明顯降低。 此外，shKAT7 imMKCLs中G0期細胞的比例增加了2倍，表明KAT7敲低后發生G0細胞週期停滯。 這些結果展示了與WM3835處理觀察到的相似表型。

相反，KAT7過表達並未改變增殖率、血小板產量或細胞周期狀態。 這些結果表明KAT7對維持imMKCLs在Dox-ON階段的細胞週期至關重要，強調了其在維持imMKCL增殖潛力和影響後續成熟階段血小板產量方面的作用。

KAT7抑制后的基因表達變化激活imMKCLs中的凝血和免疫相關通路

為了闡明KAT7抑制導致細胞週期停滯和血小板產量下降的潛在機制，我們進行了RNA測序（RNA-seq）。 差異基因表達分析顯示，WM3835處理后imMKCLs中許多基因的表達譜發生改變（1,539個上調和1,258個下調基因）。 京都基因與基因組百科全書（KEGG）和基因本體論（GO）富集表明，KAT7抑制加速了血小板啟動、補體、凝血級聯和免疫相關通路，如腫瘤壞死因數（TNF）信號通路、核因數（NF）-κB信號通路、炎症反應、對細胞因數的反應以及對I型干擾素的反應，並且TNF-α、PPBP、包括PF4在內的CXCL家族基因和干擾素相關基因突出， 表明一致的多層次免疫反應導致人巨核細胞分泌這些分子。 事實上，RNA-seq讀數和RT-qPCR分析證實，RAS樣原癌基因B（RALB）表達在WM3835處理和shKAT7 imMKCLs中均上調，表明KAT7抑制誘導imMKCLs中免疫激活狀態，其特徵是RALB調控的免疫相關基因（包括IRF7和ISG15）升高。 與此免疫偏向轉錄譜一致，KAT7抑制還導致免疫相關標誌物（包括CD53、CD54/ICAM-1、CD32和HLA-A/B/C）的表面表達增加，從而在蛋白水準上提供了KAT7缺失擴增免疫偏向MK群體的直接證據。

為進一步驗證RNA-seq觀察到的免疫反應，我們進行了RT-qPCR以量化I型干擾素和NF-κB信號通路中涉及的基因表達。 一致地，im�香港龍城大藥房全部商品�香港龍城大藥房必買商品�香港龍城中西大藥房�香港龍城藥房線上訂購�香港龍城暢銷商品�關於香港龍城大藥房�香港龍城大藥房獨家資訊�香港龍城大藥房折扣�香港龍城大藥房配送方式

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MKCLs在WM3835處理后顯示出IFI27、IFIT1、IRF7、ISG15和IFNB1（I型干擾素-β）的更高表達水準。 同時，RELB表達上調而非RELA和NFKBIA強烈提示非經典NF-κB信號通路啟動。 同樣，shKAT7克隆表現出I型干擾素和NF-κB通路的上調，表現為IFI27、IFNB1、NFKBIA、IL8和TNF表達增加。 我們還通過ELISA量化了imMKCLs培養上清液中促炎細胞因數的水準。 與RNA-seq數據一致，WM3835處理顯著增加了TNF-α、白細胞介素（IL）-8和PF4的蛋白水準，表明免疫偏向imMKCLs的啟動可能是炎症細胞因數的來源，這些細胞因數對巨核細胞成熟產生負面影響。 此外，有研究表明TNF驅動的炎症可誘導血小板過度反應性，這可能與一項關於COVID-19患者的報告有關，該報告揭示TNF依賴性免疫MKs增加是細胞因數風暴的可能原因。 這些結果強烈表明KAT7抑制驅動imMKCLs中的免疫偏向表型。

KAT7缺失導致著絲粒功能障礙並通過cGAS-STING通路觸發imMKCL免疫表型

我們最近證明免疫-MK的主導地位受RALB調控。 在那項工作中，我們揭示了免疫-MK與下調的CBX5（也稱為HP1α）相關，CBX5對異染色質組織至關重要，通過與H3K9me3組蛋白標記結合促進染色質壓縮。 CBX5缺乏已被報導會誘導染色體不穩定性，導致微核形成和著絲粒功能受損而造成染色體分離缺陷。 此外，KAT7通過拮抗Suv39h1介導的失活來協調著絲粒組裝，確保細胞分裂過程中的染色體準確分離和基因組穩定性。 Suv39h1的缺失會破壞哺乳動物異染色質結構並損害基因組穩定性。 正如預期，藥理學抑制和KAT7敲低降低了CBX5和Suv39h1，從而降低了負責調控核心著絲粒結構的基因。 此外，免疫組織化學分析顯示KAT7抑制后imMKCL中微核增加。 為提供染色質不穩定性的直接證據，我們進行了細胞內γH2AX染色以評估DNA損傷。 ST-C imMKCLs在KAT7抑制后表現出顯著升高的γH2AX水準，即使在沒有外源性DNA損傷的情況下，表明KAT7抑制導致自發性DNA損傷，並可能損害絲裂黴素C誘導損傷后的DNA修復能力。

鑒於我們發現染色體不穩定性與通過環狀鳥苷酸單磷酸-AMP合成酶（cGAS）-干擾素基因刺激物（STING）啟動的I型干擾素之間的已建立聯繫，我們假設KAT7缺失參與了這一通路。 與此一致，KAT7抑制增加了STING磷酸化。 為確定KAT7抑制觸發的I型干擾素和NF-κB級聯是否特異性依賴於cGAS-STING激活，我們用H-151（一種選擇性STING抑製劑）處理細胞。 結果顯示，H-151部分抑制了KAT7抑制依賴的I型干擾素信號啟動和NF-κB通路相關基因（RELB、NFKBIA和RELB靶點如IL-8和TNF）。 總之，我們的結果表明KAT7通過抑制cGAS-STING通路在細胞周期調控中發揮重要作用，這與imMKCLs的免疫偏向MK特性相關。

TNF-α誘導imMKCLs中G0細胞週期停滯

最後，我們檢查了免疫偏向imMKCLs釋放的細胞因數對細胞周期調控的直接影響。 雖然TNF-α給葯導致增殖呈劑量依賴性減少，但IFN-β未表現出此類效應。 TNF-α處理還導致G0間期細胞增加以及G1和G2/M期細胞相應減少，這通過FUCCI系統得到證實。 此外，TNF-α和IFN-β處理在強力黴素去除后均顯著降低了血小板生成能力。 這些結果表明KAT7是通過抑制imMKCLs中的免疫MK程式來實現G1/G2/M亞群最佳細胞分裂和高效血小板生產的關鍵調節因數。

討論

我們先前建立了imMKCLs作為體外iPSC-PLT製造的穩健平臺。 考慮到從MCB庫存解凍後或衍生工作細胞庫存的大規模最終細胞產品製造，控制增殖率至關重要。 Dox-ON階段imMKCL細胞分裂的增殖階段對於在隨後的Dox-OFF階段獲得具有優化特性的足夠細胞數量以實現高效血小板生產是必不可少的。 儘管我們已認識到增殖減少會導致血小板生產受損，但細胞增殖如何最終決定血小板生成能力仍是一個謎。 在此，我們展示了一個關鍵機制，即增殖階段KAT7介導的染色體穩定性通過抑制imMKCLs中的免疫偏向特性來調控後續血小板生產能力。 這一機制尤為重要，考慮到我們最近的發現突出了imMKCLs的異質性，其中免疫偏向imMKCLs的失調導致增殖停滯和血小板生產受損。

本研究的一個關鍵發現是增殖階段的細胞週期動態嚴格調控血小板生產。 具體而言，Dox-ON階段G1和G2/M期的細胞對血小板生成至關重要，而G0期停滯增加（特別是在老化imMKCLs中）會損害此過程。 Becker等人證明，來自小鼠胎兒肝臟的巨核細胞的血小板生產依賴於G1期的中心體聚類以啟動前血小板形成。 我們的研究在此基礎上，重點關注巨核細胞發育的早期階段，揭示了維持細胞在G1和G2/M期如何為巨核細胞成熟做準備，從而將此框架擴展到包括G1和G2/M期細胞對更高血小板產量的更廣泛貢獻。

此調控的分子機制集中在KAT7在維持染色體穩定性方面的作用。 在正常細胞增殖和分裂過程中，KAT7通過促進著絲粒處CENP-A的沉積和對抗Suv39h1介導的異染色質擴散來調控染色體穩定性。 KAT7和Suv39h1之間的這種平衡對於維持著絲粒完整性和準確的染色體分離至關重要。 實際上，KAT7缺乏會降低Suv39h1和CBX5表達，導致染色體不穩定性並隨後啟動cGAS-STING通路。 這種效應反過來將DNA損傷與先天免疫反應聯繫起來，從而促進促炎因數（如IL-6、IL-8和TNF-α）的產生。 在這些因數中，TNF-α直接觸發從G1或G2/M間期向G0的轉變，可能建立一個有害的反饋迴路，進一步損害imMKCLs的血小板生成能力。 然而，在我們的實驗設置中，需要≥10,000 pg/mL的TNF-α濃度才能對細胞週期分佈和增殖產生明顯影響，這遠高於KAT7抑制后檢測到的內源性TNF-α水準（約100 pg/mL）。 這種差異表明，生理水準的TNF-α單獨無法完全解釋觀察到的表型。 鑒於KAT7抑制誘導多種細胞因數，我們假設這些因數之間的協同相互作用導致細女士催情藥�延時噴霧劑�性用品周邊�治療性冷感�淫蕩春藥水�男士催情藥�男士助勃藥�男士持久藥�補腎壯陽藥�迷昏失憶型�陰莖增大丸

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胞週期停滯和血小板生成能力受損。

儘管我們沒有詳細比較原代巨核細胞和iPSC衍生imMKCLs的異質性，但我們的發現為這種巨核細胞異質性提供了重要見解。 最近基於單細胞RNA-seq的證據確定了不同的巨核細胞亞群，包括具有免疫偏向特性的亞群。 一致地，我們已證明imMKCLs也表現出異質性，免疫偏向亞群的失調損害iPSC-PLT生產。 在此背景下，KAT7可能作為調節血小板生成型和免疫偏向型巨核細胞之間平衡的分子開關。 年齡依賴性KAT7水準降低可能通過啟動炎症通路使這種平衡向免疫偏向亞群轉移，這讓人聯想到調控imMKCLs中免疫偏向亞群的let-7/RALB軸。

總之，我們的研究確立KAT7作為通過維持染色體穩定性將細胞週期動態與體外/體外血小板生成潛力聯繫起來的關鍵調節因數。 這些發現不僅解釋了增殖與血小板生產之間的相關性，還為監測iPSC-PLT生產的品質控制提出了新策略。 旨在維持KAT7活性或減輕其缺乏的下游效應的干預措施有望提高iPSC-PLT製造的效率和臨床適用性。