zxcvb: 超級再生：扁形蟲的幹細胞
超級再生：扁形蟲的幹細胞
3 Jan 2026 at 03:24am
幹細胞以其自我維持和分化為其他細胞類型的能力而定義。 為平衡這些過程並避免幹細胞過度增殖或耗竭，其活性通過稱為「微環境」的局部組織微環境進行調控。 已知幹細胞駐留群落及其微環境在複雜性上差異顯著：例如線蟲的單能生殖幹細胞由單個體細胞調控，而高多能造血幹細胞（HSC）則受骨髓多種細胞類型提供的完整因數生態系統調控。
淡水渦蟲Schmidtea mediterranea及其大量成體多能幹細胞對幹細胞微環境提出了獨特要求。 渦蟲幹細胞幾乎遍佈全身，密集填充於結構化器官（如腸道、咽部、神經系統、原腎管、肌肉和表皮）之間的間質空間。 在正常情況下，幹細胞持續分裂並分化為細胞前體以維持組織穩態，同時保持大量未分化細胞群。 再生過程中，它們快速增殖並能遷移至損傷部位。 然而儘管具有多能性，渦蟲幹細胞在培養中極少分裂，無法像水螅等其他無脊椎動物那樣通過懸浮細胞再生完整生物體。 這表明分化細胞可能在調控幹細胞身份、潛能、增殖和分化中起關鍵作用。 渦蟲幹細胞的獨特特性——廣泛分佈、在正常與再生條件下的動態行為，以及對細胞微環境的依賴性——凸顯了其微環境的特殊要求與可能性。 破譯這種特化微環境的結構與功能，可能揭示多細胞生物極端再生能力背後的機制。
此前，渦蟲全身豐富且廣泛分佈的幹細胞阻礙了對其微環境的全面分析，因為機體幾乎每種細胞類型都緊鄰幹細胞。 然而空間轉錄組學技術的發展使獲取接近單細胞解析度的渦蟲全身mRNA數據成為可能，從而得以詳細研究幹細胞在其微環境中的細胞架構。 研究人員採用基於10微米微球的Slide-seqV2方法，該微球能捕獲包含1-5個細胞的局部細胞微環境中的轉錄本，創建了穩態與再生過程中的渦蟲空間轉錄組圖譜。 結合現有再生渦蟲單細胞RNA測序數據，這一方法成為識別與幹細胞緊密關聯、可能參與再生能力調控的細胞類型的有力工具。
研究表明，渦蟲幹細胞位於多種細胞微環境中，其特徵是富含分泌細胞和腸道細胞。 意外發現是，儘管分泌細胞緊鄰幹細胞，但對再生過程中的幹細胞功能並非必需。 相反，腸道細胞雖通常與幹細胞相隔至少一個細胞直徑，卻在調控幹細胞增殖和空間定位中起關鍵作用。 高精度電子顯微鏡進一步闡明瞭這些微環境的性質，顯示它們缺乏明確的架構或固定組成。 此外，幹細胞極少（甚至從未）通過細胞連接與分化細胞形成穩定接觸。 這些觀察表明，渦蟲幹細胞調控主要通過遠距離介導機制而非與鄰近細胞的直接接觸。 總體而言，結果表明渦蟲幹細胞棲息於廣闊的、複雜的動態間質微環境，由多種分子和細胞微環境組成。 這些多樣化的微環境通過豐富的細胞外信號分子環境共同維持穩態與再生，這些信號分子通常源自更遠端的組織。
研究成果
淡水渦蟲S. mediterranea以其卓越再生能力聞名，這由大量成體多能幹細胞支援。 儘管在理解渦蟲再生機制方面取得顯著進展，支持幹細胞的特定局部微環境仍很大程度上不明確。 為闡明此問題，科學家應用Slide-seqV2空間轉錄組學技術，識別再生過程中與多能幹細胞相關的細胞類型和分子。 Slide-seqV2技術通過10微米帶唯一條形碼的微球捕獲組織切片中的mRNA轉錄本，使分析僅含數個細胞的局部細胞微環境成為可能。 將Slide-seqV2數據與單細胞RNA測序結果結合，科學家旨在創建高精度再生渦蟲組織空間圖譜，特別關注與幹細胞緊密關聯的細胞類型（1A）。
研究人員在截肢后6小時和48小時（hpa）採集渦蟲，對再生組織進行Slide-seqV2分析，並製備組織學和核染色對照樣本。 該方法直接從渦蟲組織捕獲大量mRNA轉錄本，有效消除背景雜訊，精確匹配微球與每個片段及其沿身體前後軸的方位。 質量過濾后分析了49,341個微球，鑒定出44個主要簇。 使用Seurat軟體包的LabelTransfer演算法確定組織歸屬，Slide-seqV2數據準確再現了已知的體內表達模式，證實了數據集可靠性。
為確定參與形成幹細胞微環境的細胞類型，僅分析包含piwi-1轉錄本（渦蟲幹細胞可靠標誌物）的微球。 在16,140個微球中（佔總數32.7%）至少含一個piwi-1轉錄本。 重新聚類piwi-1+微球揭示了意外異質性：僅11%由幹細胞轉錄組譜主導，而大多數包含顯著比例的其他細胞類型mRNA（1C）。 值得注意的是，54%與幹細胞相關的微球顯示分泌細胞特徵——這是一組先前未與幹細胞功能關聯的多樣化細胞群。 而22%顯示腸道特徵，這與此前關於幹細胞位於腸道分支間的定位研究一致。 這些結果表明，渦蟲幹細胞棲息於複雜異質微環境中，再生過程中分泌細胞和腸道細胞對其行為影響最大。
鑒於發現的幹細胞微環境異質性與多樣性，基於時間差異選擇了優先目標進行體內驗證和功能測試。 確定了每個piwi-1+微球簇中截肢后6小時和48小時樣本的比例，識別出幾個在某一時間階段佔主導的簇（儘管所有簇均包含兩個再生階段及完整個體的微球）（1D）。 其中，mmp-1+分泌微環境和富含porcupine表達的腸道微環境最為豐富。
為評估mmp-1+分泌細胞或porcupine+腸道細胞是否與幹細胞直接接觸，使用雙螢光原位雜交在完整和再生渦蟲中對這些細胞類型進行可視化。 發現mmp-1+分泌細胞在咽部周圍間質中形成環狀圖案，分佈稀疏，數量約為piwi-1+幹細胞的三分之一，形狀不規則且具明顯突起。 儘管mmp-1+分泌細胞此前已有描述，但其特性僅限於單細胞RNA測序數據。 科學家將這些大型、具突起的mmp-1+細胞命名為“百臂細胞”，以區別於分佈相似的其他細胞類型。 幹細胞也位於porcupine+腸道細胞附近及腸道分支間，但與腸道組織的直接接觸極為罕見。
為定量分析空間關係，使用CellPose程式基於高解析度共聚焦圖像對數千個細胞進行分類和定位（2A）。 通過雙螢光原位雜交和有絲分裂標誌物磷酸組蛋白H3（H3P）免疫螢光染色，測量了每個細胞到最近百臂細胞或腸道的最小距離（2B）。
發現piwi-1+幹細胞最常出現在距百臂細胞10微米範圍內，尤其在完整個體和截肢后6小時。 相反，幹細胞更常位於距腸道20-50微米處，很少在10微米內。 有絲分裂頻率僅顯示與mmp-1+細胞鄰近度的微弱統計不顯著相關性。 此外，在可視化各種特化幹細胞譜系表達因數（zfp-1， gata456-1， gata456-2， six1/2-2， tgs-1和foxA）並比對其空間定位時，發現百臂細胞鄰近度對細胞譜系特化的微弱且不一致影響。
為詳細研究細胞相互作用，科學家應用相關光電子顯微鏡（CLEM）通過mmp-1+信號識別百臂細胞（2C）。 CLEM技術精確匹配螢光與電子顯微圖像，揭示百臂細胞是充滿電子緻密分泌囊泡的大型不規則形狀細胞（2D）。 腸道細胞具有分支交錯的突起，而幹細胞則具有染色質小體（2E）。
百臂細胞體位於幹細胞附近，但未觀察到直接接觸（2F）。 然而其突起可接近幹細胞至130奈米（2G）。 相比之下，幹細胞與腸道細胞通常相隔至少1200奈米（2H），這與光學顯微鏡數據一致。 總體而言，這些結果表明渦蟲幹細胞與百臂細胞存在緊密空間關聯但無直接接觸，且與腸道細胞空間分離，證實了空間轉錄組學關於兩種細胞類型在幹細胞微環境中積累的結論。
為驗證百臂細胞或腸道是否參與調控再生過程中的幹細胞功能，研究人員首先表徵了百臂細胞中富集的基因。 先前單細胞RNA測序數據中此類細胞較少，可能因技術限制或組織解離方法特點。 因此開發了RNA-FACS-seq技術，結合組織固定、快速RNA標記和低輸入樣本測序（3A）。
渦蟲被解離固定后，使用HCRv3技術對mmp-1（百臂細胞標誌物）染色，隨後通過FACS直接將mmp-1+細胞分選至Smart-seqV4裂解緩衝液。 mmp-1+細胞被準確識別和分選，使研究人員能夠比較完整和再生個體中mmp-1+與mmp-1−細胞的基因表達譜（3B）。 數十個先前未描述的百臂細胞基因通過原位雜交確認，並與mmp-1表達共定位。
為評估百臂細胞在再生中的作用，使用RNA干擾（RNAi）降低52個與百臂細胞共定位基因的表達，並分析完整和再生渦蟲（截肢后2天和14天）的piwi-1表達水準、幹細胞分裂頻率（H3P標誌物）和mmp-1表達（3D）。 儘管幹細胞分裂速度有微小變化，但四種RNAi變體（smed30002881， dync1li， ets-2和mmp-1）導致到第14天mmp-1+細胞表達喪失（3C–3E）。 值得注意的是，ets-2抑制個體幾乎完全喪失百臂細胞基因表達（3F），表明百臂細胞本身耗竭而非僅mmp-1表達降低。
隨後，利用ets-2（RNAi）表型，研究人員直接檢驗百臂細胞喪失是否影響再生。 在額外RNAi週期后，對ets-2（RNAi）再生個體進行二次截肢（3G）。 ets-2耗竭顯著降低完整和再生個體中mmp-1+細胞數量（3H）。 然而在任何階段均未觀察到對幹細胞增殖（H3P密度; 3I）的影響，關鍵再生階段保持不變：3天時前極恢復（3J）、7天時光感受器再生（3K）及7天時腦神經節大小（3L， 3M）。
為檢驗百臂細胞是否參與耗竭幹細胞池的恢復，進行了亞致死輻射（將幹細胞數量減少至原始水準的5-10%）結合ets-2 RNAi和尾部再生。 儘管mmp-1+細胞數量顯著減少，但ets-2（RNAi）個體與對照組在分裂幹細胞密度（H3P標誌物）和輻射後存活率方面均無顯著差異。 總體而言，這些數據表明儘管mmp-1+分泌細胞（百臂細胞）與幹細胞緊密關聯並可能適度影響其增殖，但它們最終對全 organism 再生並非必需。
研究人員隨後檢驗了通過Slide-seqV2鑒定為在piwi-1+微環境中富集的腸道細胞是否調控鄰近幹細胞。 通過交叉比對單細胞RNA測序數據和原位雜交確認腸道富集潛在基因，證實其對腸道細胞的高度特異性。
通過RNAi檢驗腸道富集基因在調控幹細胞增殖中的作用時，研究人員在完整和截肢渦蟲中可視化piwi-1和H3P（4A和4B）。 與百臂細胞基因敲低不同，抑制兩個腸道基因——Smed-unc-9和微管蛋白α（tub-α）——導致截肢后48小時傷口激活幹細胞增殖出現明顯障礙：tub-α（RNAi）渦蟲完全缺乏該時期的特徵性有絲分裂激增，而完整個體的基礎增殖水準保持不變或略有升高（4C和4D）。 鑒於表型顯著性，對tub-α基因進行了更詳細分析。
在tub-α（RNAi）渦蟲中，幹細胞數量及其增殖水準在完整動物或截肢後6小時均無變化，但在48小時增殖顯著受抑——正值再生誘導的“組織喪失回應”階段（4E–4G）。 這些障礙伴隨再生缺陷：芽基形成減少或缺失、腦神經節恢復減弱、組織溶解頻繁發生（4H–4K）。 儘管腸道整體形態保持不變，但依賴幹細胞的極性信號（notum和wnt1）在48小時受損，傷口區域肌肉無顯著變化。 此外，tub-α（RNAi）渦蟲不攝取染色食物，表明攝食功能受損。
為直接評估腸道對幹細胞定位和增殖的影響，研究人員使用CellPose分析了對照unc-22（RNAi）個體和tub-α（RNAi）渦蟲的空間分佈（5A）。 後者在距腸道20微米內幹細胞較少，40微米外較多（5B）。 截肢后48小時腸道附近的增殖降低（尤其在10-20和30-40微米範圍內），儘管完整tub-α（RNAi）個體總體增殖略有升高趨勢。
為研究tub-α在再生中的更廣泛效應，在截肢后48小時對tub-α（RNAi）個體和對照組進行單細胞RNA測序。 數據整合揭示33個簇，對應已知渦蟲細胞類型多樣性（5C， 5D）。 tub-α抑制后數量相對最少的是兩個具幹細胞特性的簇——14和18（5E）。 差異表達分析還顯示對特徵為腸道基因porcupine的簇8的顯著影響（5F）。 根據先前研究，如載脂蛋白B和轉錄因數nkx2.2等腸道基因在再生中起關鍵作用。 在tub-α（RNAi）作用下，apoB1表達增加40%，
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apoB2降低22%，nkx2.2適度增加29%。 原位雜交證實apoB基因的空間表達模式保持不變。
總體而言，這些數據表明腸道組織尤其是tub-α在幹細胞定位、損傷誘導增殖和成功再生中起關鍵作用。 因此，若百臂細胞對恢復無關緊要，則腸道與幹細胞的相互作用反而是再生成功的關鍵因素。
百臂細胞和腸道細胞的功能分析揭示了渦蟲幹細胞微環境的兩個顯著特徵。 首先，即使最近的鄰近細胞（百臂細胞）對維持幹細胞功能在生長和再生過程中也無足輕重。 其次，調控幹細胞活性的腸道細胞並不與它們形成直接物理接觸。 考慮到空間轉錄組測序揭示的微環境多樣性，問題產生：渦蟲幹細胞是否與任何分化細胞類型形成細胞連接？
細胞連接在電子顯微照片中表現為相鄰細胞膜沿線的電子緻密區域。 為驗證電子顯微樣本中這些結構的完整性，分析了通常存在黏附和緊密連接的表皮和腸道組織。 發現表皮中存在對應黏附連接的平行電子緻密區域，腸道中則存在表徵緊密連接的單條電子緻密線。 此外，觀察到原腎管細胞與間質吞噬細胞之間的同型連接，以及原腎管與吞噬細胞之間的異型相互作用（6A）。
為確定幹細胞是否與分化細胞形成連接，研究人員重建了CLEM數據集和額外電子顯微圖像集中每個幹細胞的體積，總共分析了263個幹細胞和200個分化細胞（6B和6C）。 細胞鑒定基於已知的超微結構特徵。 發現69.5%的分化細胞包含細胞連接（6D），而在所有分析的263個幹細胞中僅發現一個潛在連接——幹細胞與吞噬細胞突起之間的微弱相互作用，其電子密度低且顯著弱於典型黏附或緊密連接（6E）。
還分析了幹細胞與細胞外基質（ECM）的相互作用。 注意到橫穿間質的肌肉細胞常顯示ECM完整性破壞，這與肌肉組織表達的細胞外基質蛋白一致。 而包圍幹細胞的細胞外基質與其他間質區域無差異。 總體而言，電子顯微分析數據顯示渦蟲中幹細胞與分化細胞之間的穩定連接極為罕見（若存在）。 這種結構獨立性表明渦蟲幹細胞在靈活且組織鬆散的微環境中運作，而非依賴與鄰近細胞的持續物理連接。
為更詳細研究幹細胞所處微環境，研究人員分析了體積電子顯微數據集，並將其結果與空間轉錄組測序數據比對。 從第一個電子顯微數據集中隨機選擇21個幹細胞（排除冷凍損傷、無核或圖像不全的細胞）。 為每個選定細胞重建其完整體積及其最近鄰細胞，實現相應微環境的三維重建（7A）。
三維重建顯示幹細胞微環境具有顯著變異性：幹細胞幾乎緊鄰間質所有主要細胞類型（7B）。 在21個研究案例中未發現重複或典型微環境。 為識別規律，為每個幹細胞創建最近鄰細胞表，並與先前用於分析細胞連接的100個分化細胞進行比較（6B和6C）。 發現構成結構化組織（如腸道、表皮和肌肉）的細胞具有同質微環境，而幹細胞和間質分化細胞處於高度變異的微環境中，其中分泌細胞、肌纖維、吞噬細胞和其他幹細胞佔主導（7C）。
值得注意的是，在21個研究幹細胞中僅有一個的直接鄰近細胞為腸道細胞，證實幹細胞與腸道細胞的直接接觸極為罕見。 分泌細胞和背腹肌纖維也是常見鄰近細胞，且分泌細胞在幹細胞附近略有富集，這與電子顯微分析和空間轉錄組測序數據一致。 吞噬細胞是最常見鄰近細胞，幾乎與所有幹細胞和分化細胞相鄰，通常通過空間轉錄組測序解析度無法解析度無法解析度的細長突起。 總體而言，這些結果表明渦蟲幹細胞棲息於多樣化間質微環境中，其中存在分化細胞之間的分支接觸網路，但與幹細胞幾乎完全缺乏穩定連接。
尾聲
在本研究中，科學家試圖破解渦蟲之謎——這種生物能在嚴重身體損傷后再生。 研究發現幹細胞及其異常行為起著巨大作用。
在大多數動物中，幹細胞依賴鄰近細胞發出指令。 但渦蟲幹細胞行為不同。 它們不聽從直接鄰居，而是接收來自機體更遠端細胞的指令。 成年渦蟲幹細胞可轉化為任何細胞類型，不同於大多數動物的幹細胞（通常嚴格限於生成少數細胞類型）。 這種嚴格控制有助於防止不受控生長——可能導致癌症的過程。
利用先進的空間轉錄組學方法，科學家研究了單個細胞及其環境中活躍的基因。 這揭示了意外的鄰近細胞，包括一種先前未描述的大型細胞——表面具有眾多指狀突起。 研究人員以希臘神話中多臂巨人赫卡同克瑞斯命名這些細胞為「百臂細胞」。。 然而，儘管這些細胞緊鄰幹細胞，卻絲毫不影響其功能。 這一發現與典型幹細胞與微環境關聯邏輯相悖。
不是鄰近細胞接管控制，最嚴格的指令來體愛飛機杯陰蒂高潮液陰莖增大藥陰莖增大膏陰莖增大器速效雙效藥速效持久藥速效勃起藥迷情型藥費洛蒙香水聽話型乖乖水男性用藥男性外抹藥淫汁水昏睡藥持久延時液女性春藥女性外塗失憶型藥增慾按摩油增慾催情藥口交潤滑液印度神油液催情藥保養增強藥自腸道細胞——數據集中第二常見類型。 這些遠端細胞似乎影響渦蟲幹細胞在再生過程中的位置和功能，即使相距甚遠。 研究表明，渦蟲幹細胞無需固定、基於接觸的微環境運作。 實際上，幹細胞附近不存在特定細胞類型或因素控制其身份。
科學家指出，更重大的發現是：至少在渦蟲中，幹細胞所處環境並非恆定。 相反，它是動態的：幹細胞棲息地本質上由幹細胞及其後代在分化過程中創造的“朋友”形成。
這些結果對理解人類再生原理具有重要意義。 它們表明，成功組織再生可能不僅取決於幹細胞存在，更取決於其微環境特性——靈活、化學活躍且能在無嚴格結構框架下指導分裂和分化過程。 理解這些機制為開發通過調控細胞信號和組織相互作用（而非僅依賴移植或基因治療）來刺激機體自體再生能力的治療策略開闢了道路。
淡水渦蟲Schmidtea mediterranea及其大量成體多能幹細胞對幹細胞微環境提出了獨特要求。 渦蟲幹細胞幾乎遍佈全身，密集填充於結構化器官（如腸道、咽部、神經系統、原腎管、肌肉和表皮）之間的間質空間。 在正常情況下，幹細胞持續分裂並分化為細胞前體以維持組織穩態，同時保持大量未分化細胞群。 再生過程中，它們快速增殖並能遷移至損傷部位。 然而儘管具有多能性，渦蟲幹細胞在培養中極少分裂，無法像水螅等其他無脊椎動物那樣通過懸浮細胞再生完整生物體。 這表明分化細胞可能在調控幹細胞身份、潛能、增殖和分化中起關鍵作用。 渦蟲幹細胞的獨特特性——廣泛分佈、在正常與再生條件下的動態行為，以及對細胞微環境的依賴性——凸顯了其微環境的特殊要求與可能性。 破譯這種特化微環境的結構與功能，可能揭示多細胞生物極端再生能力背後的機制。
此前，渦蟲全身豐富且廣泛分佈的幹細胞阻礙了對其微環境的全面分析，因為機體幾乎每種細胞類型都緊鄰幹細胞。 然而空間轉錄組學技術的發展使獲取接近單細胞解析度的渦蟲全身mRNA數據成為可能，從而得以詳細研究幹細胞在其微環境中的細胞架構。 研究人員採用基於10微米微球的Slide-seqV2方法，該微球能捕獲包含1-5個細胞的局部細胞微環境中的轉錄本，創建了穩態與再生過程中的渦蟲空間轉錄組圖譜。 結合現有再生渦蟲單細胞RNA測序數據，這一方法成為識別與幹細胞緊密關聯、可能參與再生能力調控的細胞類型的有力工具。
研究表明，渦蟲幹細胞位於多種細胞微環境中，其特徵是富含分泌細胞和腸道細胞。 意外發現是，儘管分泌細胞緊鄰幹細胞，但對再生過程中的幹細胞功能並非必需。 相反，腸道細胞雖通常與幹細胞相隔至少一個細胞直徑，卻在調控幹細胞增殖和空間定位中起關鍵作用。 高精度電子顯微鏡進一步闡明瞭這些微環境的性質，顯示它們缺乏明確的架構或固定組成。 此外，幹細胞極少（甚至從未）通過細胞連接與分化細胞形成穩定接觸。 這些觀察表明，渦蟲幹細胞調控主要通過遠距離介導機制而非與鄰近細胞的直接接觸。 總體而言，結果表明渦蟲幹細胞棲息於廣闊的、複雜的動態間質微環境，由多種分子和細胞微環境組成。 這些多樣化的微環境通過豐富的細胞外信號分子環境共同維持穩態與再生，這些信號分子通常源自更遠端的組織。
研究成果
淡水渦蟲S. mediterranea以其卓越再生能力聞名，這由大量成體多能幹細胞支援。 儘管在理解渦蟲再生機制方面取得顯著進展，支持幹細胞的特定局部微環境仍很大程度上不明確。 為闡明此問題，科學家應用Slide-seqV2空間轉錄組學技術，識別再生過程中與多能幹細胞相關的細胞類型和分子。 Slide-seqV2技術通過10微米帶唯一條形碼的微球捕獲組織切片中的mRNA轉錄本，使分析僅含數個細胞的局部細胞微環境成為可能。 將Slide-seqV2數據與單細胞RNA測序結果結合，科學家旨在創建高精度再生渦蟲組織空間圖譜，特別關注與幹細胞緊密關聯的細胞類型（1A）。
研究人員在截肢后6小時和48小時（hpa）採集渦蟲，對再生組織進行Slide-seqV2分析，並製備組織學和核染色對照樣本。 該方法直接從渦蟲組織捕獲大量mRNA轉錄本，有效消除背景雜訊，精確匹配微球與每個片段及其沿身體前後軸的方位。 質量過濾后分析了49,341個微球，鑒定出44個主要簇。 使用Seurat軟體包的LabelTransfer演算法確定組織歸屬，Slide-seqV2數據準確再現了已知的體內表達模式，證實了數據集可靠性。
為確定參與形成幹細胞微環境的細胞類型，僅分析包含piwi-1轉錄本（渦蟲幹細胞可靠標誌物）的微球。 在16,140個微球中（佔總數32.7%）至少含一個piwi-1轉錄本。 重新聚類piwi-1+微球揭示了意外異質性：僅11%由幹細胞轉錄組譜主導，而大多數包含顯著比例的其他細胞類型mRNA（1C）。 值得注意的是，54%與幹細胞相關的微球顯示分泌細胞特徵——這是一組先前未與幹細胞功能關聯的多樣化細胞群。 而22%顯示腸道特徵，這與此前關於幹細胞位於腸道分支間的定位研究一致。 這些結果表明，渦蟲幹細胞棲息於複雜異質微環境中，再生過程中分泌細胞和腸道細胞對其行為影響最大。
鑒於發現的幹細胞微環境異質性與多樣性，基於時間差異選擇了優先目標進行體內驗證和功能測試。 確定了每個piwi-1+微球簇中截肢后6小時和48小時樣本的比例，識別出幾個在某一時間階段佔主導的簇（儘管所有簇均包含兩個再生階段及完整個體的微球）（1D）。 其中，mmp-1+分泌微環境和富含porcupine表達的腸道微環境最為豐富。
為評估mmp-1+分泌細胞或porcupine+腸道細胞是否與幹細胞直接接觸，使用雙螢光原位雜交在完整和再生渦蟲中對這些細胞類型進行可視化。 發現mmp-1+分泌細胞在咽部周圍間質中形成環狀圖案，分佈稀疏，數量約為piwi-1+幹細胞的三分之一，形狀不規則且具明顯突起。 儘管mmp-1+分泌細胞此前已有描述，但其特性僅限於單細胞RNA測序數據。 科學家將這些大型、具突起的mmp-1+細胞命名為“百臂細胞”，以區別於分佈相似的其他細胞類型。 幹細胞也位於porcupine+腸道細胞附近及腸道分支間，但與腸道組織的直接接觸極為罕見。
為定量分析空間關係，使用CellPose程式基於高解析度共聚焦圖像對數千個細胞進行分類和定位（2A）。 通過雙螢光原位雜交和有絲分裂標誌物磷酸組蛋白H3（H3P）免疫螢光染色，測量了每個細胞到最近百臂細胞或腸道的最小距離（2B）。
發現piwi-1+幹細胞最常出現在距百臂細胞10微米範圍內，尤其在完整個體和截肢后6小時。 相反，幹細胞更常位於距腸道20-50微米處，很少在10微米內。 有絲分裂頻率僅顯示與mmp-1+細胞鄰近度的微弱統計不顯著相關性。 此外，在可視化各種特化幹細胞譜系表達因數（zfp-1， gata456-1， gata456-2， six1/2-2， tgs-1和foxA）並比對其空間定位時，發現百臂細胞鄰近度對細胞譜系特化的微弱且不一致影響。
為詳細研究細胞相互作用，科學家應用相關光電子顯微鏡（CLEM）通過mmp-1+信號識別百臂細胞（2C）。 CLEM技術精確匹配螢光與電子顯微圖像，揭示百臂細胞是充滿電子緻密分泌囊泡的大型不規則形狀細胞（2D）。 腸道細胞具有分支交錯的突起，而幹細胞則具有染色質小體（2E）。
百臂細胞體位於幹細胞附近，但未觀察到直接接觸（2F）。 然而其突起可接近幹細胞至130奈米（2G）。 相比之下，幹細胞與腸道細胞通常相隔至少1200奈米（2H），這與光學顯微鏡數據一致。 總體而言，這些結果表明渦蟲幹細胞與百臂細胞存在緊密空間關聯但無直接接觸，且與腸道細胞空間分離，證實了空間轉錄組學關於兩種細胞類型在幹細胞微環境中積累的結論。
為驗證百臂細胞或腸道是否參與調控再生過程中的幹細胞功能，研究人員首先表徵了百臂細胞中富集的基因。 先前單細胞RNA測序數據中此類細胞較少，可能因技術限制或組織解離方法特點。 因此開發了RNA-FACS-seq技術，結合組織固定、快速RNA標記和低輸入樣本測序（3A）。
渦蟲被解離固定后，使用HCRv3技術對mmp-1（百臂細胞標誌物）染色，隨後通過FACS直接將mmp-1+細胞分選至Smart-seqV4裂解緩衝液。 mmp-1+細胞被準確識別和分選，使研究人員能夠比較完整和再生個體中mmp-1+與mmp-1−細胞的基因表達譜（3B）。 數十個先前未描述的百臂細胞基因通過原位雜交確認，並與mmp-1表達共定位。
為評估百臂細胞在再生中的作用，使用RNA干擾（RNAi）降低52個與百臂細胞共定位基因的表達，並分析完整和再生渦蟲（截肢后2天和14天）的piwi-1表達水準、幹細胞分裂頻率（H3P標誌物）和mmp-1表達（3D）。 儘管幹細胞分裂速度有微小變化，但四種RNAi變體（smed30002881， dync1li， ets-2和mmp-1）導致到第14天mmp-1+細胞表達喪失（3C–3E）。 值得注意的是，ets-2抑制個體幾乎完全喪失百臂細胞基因表達（3F），表明百臂細胞本身耗竭而非僅mmp-1表達降低。
隨後，利用ets-2（RNAi）表型，研究人員直接檢驗百臂細胞喪失是否影響再生。 在額外RNAi週期后，對ets-2（RNAi）再生個體進行二次截肢（3G）。 ets-2耗竭顯著降低完整和再生個體中mmp-1+細胞數量（3H）。 然而在任何階段均未觀察到對幹細胞增殖（H3P密度; 3I）的影響，關鍵再生階段保持不變：3天時前極恢復（3J）、7天時光感受器再生（3K）及7天時腦神經節大小（3L， 3M）。
為檢驗百臂細胞是否參與耗竭幹細胞池的恢復，進行了亞致死輻射（將幹細胞數量減少至原始水準的5-10%）結合ets-2 RNAi和尾部再生。 儘管mmp-1+細胞數量顯著減少，但ets-2（RNAi）個體與對照組在分裂幹細胞密度（H3P標誌物）和輻射後存活率方面均無顯著差異。 總體而言，這些數據表明儘管mmp-1+分泌細胞（百臂細胞）與幹細胞緊密關聯並可能適度影響其增殖，但它們最終對全 organism 再生並非必需。
研究人員隨後檢驗了通過Slide-seqV2鑒定為在piwi-1+微環境中富集的腸道細胞是否調控鄰近幹細胞。 通過交叉比對單細胞RNA測序數據和原位雜交確認腸道富集潛在基因，證實其對腸道細胞的高度特異性。
通過RNAi檢驗腸道富集基因在調控幹細胞增殖中的作用時，研究人員在完整和截肢渦蟲中可視化piwi-1和H3P（4A和4B）。 與百臂細胞基因敲低不同，抑制兩個腸道基因——Smed-unc-9和微管蛋白α（tub-α）——導致截肢后48小時傷口激活幹細胞增殖出現明顯障礙：tub-α（RNAi）渦蟲完全缺乏該時期的特徵性有絲分裂激增，而完整個體的基礎增殖水準保持不變或略有升高（4C和4D）。 鑒於表型顯著性，對tub-α基因進行了更詳細分析。
在tub-α（RNAi）渦蟲中，幹細胞數量及其增殖水準在完整動物或截肢後6小時均無變化，但在48小時增殖顯著受抑——正值再生誘導的“組織喪失回應”階段（4E–4G）。 這些障礙伴隨再生缺陷：芽基形成減少或缺失、腦神經節恢復減弱、組織溶解頻繁發生（4H–4K）。 儘管腸道整體形態保持不變，但依賴幹細胞的極性信號（notum和wnt1）在48小時受損，傷口區域肌肉無顯著變化。 此外，tub-α（RNAi）渦蟲不攝取染色食物，表明攝食功能受損。
為直接評估腸道對幹細胞定位和增殖的影響，研究人員使用CellPose分析了對照unc-22（RNAi）個體和tub-α（RNAi）渦蟲的空間分佈（5A）。 後者在距腸道20微米內幹細胞較少，40微米外較多（5B）。 截肢后48小時腸道附近的增殖降低（尤其在10-20和30-40微米範圍內），儘管完整tub-α（RNAi）個體總體增殖略有升高趨勢。
為研究tub-α在再生中的更廣泛效應，在截肢后48小時對tub-α（RNAi）個體和對照組進行單細胞RNA測序。 數據整合揭示33個簇，對應已知渦蟲細胞類型多樣性（5C， 5D）。 tub-α抑制后數量相對最少的是兩個具幹細胞特性的簇——14和18（5E）。 差異表達分析還顯示對特徵為腸道基因porcupine的簇8的顯著影響（5F）。 根據先前研究，如載脂蛋白B和轉錄因數nkx2.2等腸道基因在再生中起關鍵作用。 在tub-α（RNAi）作用下，apoB1表達增加40%，
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apoB2降低22%，nkx2.2適度增加29%。 原位雜交證實apoB基因的空間表達模式保持不變。
總體而言，這些數據表明腸道組織尤其是tub-α在幹細胞定位、損傷誘導增殖和成功再生中起關鍵作用。 因此，若百臂細胞對恢復無關緊要，則腸道與幹細胞的相互作用反而是再生成功的關鍵因素。
百臂細胞和腸道細胞的功能分析揭示了渦蟲幹細胞微環境的兩個顯著特徵。 首先，即使最近的鄰近細胞（百臂細胞）對維持幹細胞功能在生長和再生過程中也無足輕重。 其次，調控幹細胞活性的腸道細胞並不與它們形成直接物理接觸。 考慮到空間轉錄組測序揭示的微環境多樣性，問題產生：渦蟲幹細胞是否與任何分化細胞類型形成細胞連接？
細胞連接在電子顯微照片中表現為相鄰細胞膜沿線的電子緻密區域。 為驗證電子顯微樣本中這些結構的完整性，分析了通常存在黏附和緊密連接的表皮和腸道組織。 發現表皮中存在對應黏附連接的平行電子緻密區域，腸道中則存在表徵緊密連接的單條電子緻密線。 此外，觀察到原腎管細胞與間質吞噬細胞之間的同型連接，以及原腎管與吞噬細胞之間的異型相互作用（6A）。
為確定幹細胞是否與分化細胞形成連接，研究人員重建了CLEM數據集和額外電子顯微圖像集中每個幹細胞的體積，總共分析了263個幹細胞和200個分化細胞（6B和6C）。 細胞鑒定基於已知的超微結構特徵。 發現69.5%的分化細胞包含細胞連接（6D），而在所有分析的263個幹細胞中僅發現一個潛在連接——幹細胞與吞噬細胞突起之間的微弱相互作用，其電子密度低且顯著弱於典型黏附或緊密連接（6E）。
還分析了幹細胞與細胞外基質（ECM）的相互作用。 注意到橫穿間質的肌肉細胞常顯示ECM完整性破壞，這與肌肉組織表達的細胞外基質蛋白一致。 而包圍幹細胞的細胞外基質與其他間質區域無差異。 總體而言，電子顯微分析數據顯示渦蟲中幹細胞與分化細胞之間的穩定連接極為罕見（若存在）。 這種結構獨立性表明渦蟲幹細胞在靈活且組織鬆散的微環境中運作，而非依賴與鄰近細胞的持續物理連接。
為更詳細研究幹細胞所處微環境，研究人員分析了體積電子顯微數據集，並將其結果與空間轉錄組測序數據比對。 從第一個電子顯微數據集中隨機選擇21個幹細胞（排除冷凍損傷、無核或圖像不全的細胞）。 為每個選定細胞重建其完整體積及其最近鄰細胞，實現相應微環境的三維重建（7A）。
三維重建顯示幹細胞微環境具有顯著變異性：幹細胞幾乎緊鄰間質所有主要細胞類型（7B）。 在21個研究案例中未發現重複或典型微環境。 為識別規律，為每個幹細胞創建最近鄰細胞表，並與先前用於分析細胞連接的100個分化細胞進行比較（6B和6C）。 發現構成結構化組織（如腸道、表皮和肌肉）的細胞具有同質微環境，而幹細胞和間質分化細胞處於高度變異的微環境中，其中分泌細胞、肌纖維、吞噬細胞和其他幹細胞佔主導（7C）。
值得注意的是，在21個研究幹細胞中僅有一個的直接鄰近細胞為腸道細胞，證實幹細胞與腸道細胞的直接接觸極為罕見。 分泌細胞和背腹肌纖維也是常見鄰近細胞，且分泌細胞在幹細胞附近略有富集，這與電子顯微分析和空間轉錄組測序數據一致。 吞噬細胞是最常見鄰近細胞，幾乎與所有幹細胞和分化細胞相鄰，通常通過空間轉錄組測序解析度無法解析度無法解析度的細長突起。 總體而言，這些結果表明渦蟲幹細胞棲息於多樣化間質微環境中，其中存在分化細胞之間的分支接觸網路，但與幹細胞幾乎完全缺乏穩定連接。
尾聲
在本研究中，科學家試圖破解渦蟲之謎——這種生物能在嚴重身體損傷后再生。 研究發現幹細胞及其異常行為起著巨大作用。
在大多數動物中，幹細胞依賴鄰近細胞發出指令。 但渦蟲幹細胞行為不同。 它們不聽從直接鄰居，而是接收來自機體更遠端細胞的指令。 成年渦蟲幹細胞可轉化為任何細胞類型，不同於大多數動物的幹細胞（通常嚴格限於生成少數細胞類型）。 這種嚴格控制有助於防止不受控生長——可能導致癌症的過程。
利用先進的空間轉錄組學方法，科學家研究了單個細胞及其環境中活躍的基因。 這揭示了意外的鄰近細胞，包括一種先前未描述的大型細胞——表面具有眾多指狀突起。 研究人員以希臘神話中多臂巨人赫卡同克瑞斯命名這些細胞為「百臂細胞」。。 然而，儘管這些細胞緊鄰幹細胞，卻絲毫不影響其功能。 這一發現與典型幹細胞與微環境關聯邏輯相悖。
不是鄰近細胞接管控制，最嚴格的指令來體愛飛機杯陰蒂高潮液陰莖增大藥陰莖增大膏陰莖增大器速效雙效藥速效持久藥速效勃起藥迷情型藥費洛蒙香水聽話型乖乖水男性用藥男性外抹藥淫汁水昏睡藥持久延時液女性春藥女性外塗失憶型藥增慾按摩油增慾催情藥口交潤滑液印度神油液催情藥保養增強藥自腸道細胞——數據集中第二常見類型。 這些遠端細胞似乎影響渦蟲幹細胞在再生過程中的位置和功能，即使相距甚遠。 研究表明，渦蟲幹細胞無需固定、基於接觸的微環境運作。 實際上，幹細胞附近不存在特定細胞類型或因素控制其身份。
科學家指出，更重大的發現是：至少在渦蟲中，幹細胞所處環境並非恆定。 相反，它是動態的：幹細胞棲息地本質上由幹細胞及其後代在分化過程中創造的“朋友”形成。
這些結果對理解人類再生原理具有重要意義。 它們表明，成功組織再生可能不僅取決於幹細胞存在，更取決於其微環境特性——靈活、化學活躍且能在無嚴格結構框架下指導分裂和分化過程。 理解這些機制為開發通過調控細胞信號和組織相互作用（而非僅依賴移植或基因治療）來刺激機體自體再生能力的治療策略開闢了道路。
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