GFHDT: 衰老相關miR-23b-3p在間充質基質細胞外囊泡中的表達變化影響TGFBR3信號傳導

研究表明，細胞外囊泡（EVs）攜帶如微小RNA（miRNAs）和細胞因數等生物介質，在調節受體組織中起著關鍵作用，並被認為是細胞治療的關鍵機制。 然而，發現供體細胞的細胞老化顯著影響這些參與細胞間通訊的介質的表達譜。 在這項研究中，我們確定了miR-23b-3p作為通過靶向TGFBR3調控幹性相關基因的調節因數，其在年輕和老年供體的間充質幹細胞（MSCs）中表達不同。 在老年MSCs中，人類MIR23B啟動子區域的高甲基化導致其下調。 用去甲基化劑丙戊酸（VPA）處理可恢復miR-23b-3p的表達，並促進其融入EVs。 我們的研究結果表明，MSCs的老化會改變EVs的miRNA組成，可能破壞細胞間通訊，並顯著影響細胞移植的療效。 為解決這一問題，誘導去甲基化可能成為提高MSCs治療效果的一種有前景的策略。

引言

間充質幹細胞（MSCs）是存在於多種組織中的多能基質細胞，包括骨髓。 它們通過分泌生物活性因數如細胞因數、生長因數和細胞外囊泡來維持組織穩態，並調節免疫反應和促進組織修復。 利用這些特性，基於MSC的細胞移植療法在過去十年中在全球範圍內迅速擴展，顯示出在治療一系列炎症和退行性疾病方面的潛力[1]。 另一方面，MSCs受到細胞老化和衰老的影響，導致功能減弱和療效降低[2,3,4,5]。 細胞老化在MSCs中引起轉錄變化，由氧化應激和表觀遺傳修飾（包括DNA甲基化和組蛋白修飾）驅動[6,7,8]。 這些表觀遺傳變化擾亂了維持干性和再生能力至關重要的基因表達模式。 值得注意的是，衰老會影響MSCs分泌的EVs的組成，這些EVs作為載體參與遠處細胞的轉錄后調節[9,10,11]。 EVs中miRNA含量的變化可以損害細胞間通訊，影響幹細胞維持、免疫反應、細胞外基質表達和血管生成等過程[12,13,14,15,16]。 miRNA在EVs中的年齡相關表達變化可以改變細胞間通訊，潛在影響各種生理過程[17,18,19]。 鑒於MSCs在維持造血功能、上皮細胞功能和血管完整性方面的重要作用[20,21]，闡明EVs中與年齡相關的miRNA表達變化對於理解與年齡相關的生理變化機制至關重要。 研究這些與年齡相關的改變及其在老年MSCs中的信號通路不僅能夠增強基於MSC的移植療法的效果，還能提供有關人類衰老機制的寶貴見解。

在這項研究中，我們證明瞭miR-23b-3p是一種存在於EVs中的受老化影響的miRNA，在老年細胞中表達水準下降，導致其靶基因TGFBR3上調。 我們還發現，MIR23B基因上游區域的多個CpG位點，並顯示在衰老模型細胞中用去甲基化劑丙戊酸（VPA）處理可以恢復EVs中的miR-23b-3p水準。

材料和方法

人體材料研究的倫理考量

近畿大學醫學部機構審查委員會批准了人體組織採集的方案，批准的研究項目編號為R03-041。 組織樣本是從近畿大學醫院接受脊柱手術的患者中收集的，並獲得了知情同意。 所有方法均按照相關指南和規定執行。

動物研究的倫理考量

所有涉及動物處理、護理、手術和犧牲的程式均由近畿大學機構動物護理和使用委員會批准，批准的研究專案編號為KAME2022-062，並按照機構指南和規定執行。 所有方法均按照ARRIVE指南報告。

小鼠骨髓間充質基質細胞（BMMSCs）的製備

本研究中使用的所有小鼠均購自CLEA Japan公司（大阪，日本）。 小鼠在符合機構和國際指南的受控條件下飼養和維護。 三到四周齡的雄性C57BL/6J（B6）小鼠作為年輕模型，而20至24個月齡的雄性B6小鼠作為老年模型。 小鼠BMMSCs按先前描述的方法分離。 簡而言之，清洗后的股骨和脛骨被切成小塊，並用0.1%膠原酶II型（Wako，東京，日本）處理15分鐘。 含有BMMSCs的單細胞懸液被收集，用PBS洗滌兩次，並接種在細胞培養皿（Sumilon，住友貝克力有限公司，東京，日本）中，在補充有200 mM L-谷氨醯胺和10%胎牛血清（CORNING，洛厄爾，美國）的αMEM（賽默飛世爾科技，沃爾瑟姆，美國）中，置於5% CO2和5% O2條件下37�C培養。 第二天更換培養基以去除死細胞和碎片。 經過10天的培養，用TrypLE（賽默飛世爾科技）分離BMMSCs進行進一步實驗。 實驗中使用了不超過三代的BMMSCs。

人BMMSCs的製備和培養

本研究使用的標本是在脊柱和膝關節手術過程中收集的骨髓液體副產品。 所有樣本均在獲得患者知情同意后取得，除標準手術技術外未進行額外侵入性操作以收集樣本。 排除感染、惡性腫瘤或慢性免疫疾病（如系統性紅斑狼瘡或類風濕性關節炎）的患者。 樣本分為兩組：年輕組（25-44歲）和老年組（65-95歲）。

從接受手術的患者中收集4毫升骨髓血液。 將骨髓血液與含10% FCS的DMEM混合，接種於100毫米培養皿中，37�C、5% CO₂和5% O₂條件下培養。 第二天更換培養基以去除紅細胞和其他漂浮血細胞，細胞培養10天，每3天更換一次培養基。

細胞外囊泡（EVs）的收集和純化

對於每個實驗，準備四份100毫米培養皿中的亞匯合MSCs。 將培養基替換為添加了無EV牛血清的DMEM，該牛血清通過超離心處理去除了EVs，並將細胞孵育48小時。 孵育后，收集所有培養基，4�C下以10,000 g離心10分鐘，然後通過0.45 μm濾器過濾。 將上清液轉移到40 PA管（Eppendorf Himac Technologies Co.， Ltd.， 茨木市，日本）中進行超離心。 將試管放置在Himac CP80NX超離心機（Eppendorf Himac Technologies Co.， Ltd.）中，在4�C下以130,000 g離心70分鐘。 去除上清液后，將所得沉澱用0.1% PVA-PBS洗滌，轉移到3.5 mL開口厚壁聚碳酸酯管（貝克曼庫爾特，佈雷亞，加利福尼亞州，美國），並在4�C下再次以130,000 g離心70分鐘，使用TL-100（貝克曼庫爾特）。 純化的EVs以20 μg/mL的濃度加入細胞，或用於總RNA提取，隨後用於miRNA陣列和RT-PCR實驗。

miRNA微陣列分析

使用TRIzol試劑（賽默飛世爾科技）提取的總RNA和Affymetrics GeneChip miRNA 4.0陣列（賽默飛世爾科技）平台進行微陣列基因表達分析，並使用Affymetrix Transcriptome Analysis Console軟體（賽默飛世爾科技）進行數據分析。

定量RT-PCR（qRT-PCR）

使用TRI Reagent�（分子研究中心公司，辛辛那提，俄亥俄州，美國）從MSCs中提取總RNA，並用PrimeScript� RT Master Mix Kit（寶生物工程公司，滋賀縣，日本）進行反轉錄。 使用Perfect Real-Time SYBR Green II（寶生物工程公司）和補充表S1中列出的特異性引物進行RT-PCR。 為避免擴增污染的基因組DNA，所有引物設計至少跨越一個內含子。 使用Mir-X™ miRNA定量系統對miRNAs進行定量RT-PCR。 從細胞或EVs中提取的總RNA經Mir-X™ miRNA第一鏈合成試劑盒（寶生物工程公司）進行反轉錄。 細胞中miRNA的相對表達通過將miR-23b-3p的表達水準標準化到同一樣本中的GAPDH進行評估，而EVs中miRNA的表達則標準化到miR-451a-5p。

各miRNA的特異性5′引物如下：

• mmu/hsa-miR-23b-3p: ATCACATTGCCAGGGATTAC印度原裝進口壯陽藥哪裡買�無副作用植物壯陽補品�增強性能力天然草本配方�改善早洩的口服產品�男性持久力不足怎麼辦�長期調理男性功能保健食品�壯陽產品有用嗎CAC,


• hsa-miR-451a-5p: AAACCGTTACCATTACTGAGTT,


• mmu-miR-451a-5p: AAACCGTTACCATTACTGAGTT.

使用miRNA類比物或siRNA處理原代MSCs

使用Lipofectamine� RNAiMAX（賽默飛世爾科技）按照製造商說明將原代MSCs轉染miRNA類比物或siRNA。 由GeneDesign公司（大阪，日本）合成的mmu/hsa-miR-23b-3p miRNA類比物序列如下：AUCACAUUGCCAGGGAUUACC/AUCACAUUGCCAGGGAUUACCAC。 來自秀麗隱桿線蟲的cel-miR-67-3p序列：UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA用作對照miRNA。 阻斷Tgfbr3的siRNA由Japan Bio Services Co.， LTD.（埼玉縣，日本）合成，序列為：

正義序列-CUU AAG AUA GCA AGA AAU AdTdT 和反義序列-UAU UUC UUG CUA UCU UAA GdTdT。 轉染48小時后收集細胞用於RT-PCR、WB或蛋白質組學分析。

蛋白質組分析樣品製備

使用RIPA緩衝液提取蛋白質並用BCA測定法測定濃度。 使用胰蛋白酶以1：50的比例在37�C下消化過夜。 所得肽段用C18柱脫鹽並用真空離心乾燥。

色譜和質譜分析

肽混合物在含有0.1%甲酸的溶液中重新溶解，並使用Vanquish Neo UHPLC系統（賽默飛世爾科技）配備Aurora Ultimator柱（IonOpticks，菲茨羅伊，維多利亞，澳大利亞）進行液相色譜分析。 質譜分析使用Orbitrap Exploris 480（賽默飛世爾科技）進行。 使用Thermo Proteome Discoverer ver 2.5.0.400處理質譜數據。 原始檔使用SEQUEST演算法針對UniProt人類資料庫進行搜索。 肽和蛋白質鑒定在肽和蛋白質水準上的錯誤發現率（FDR）<1%進行過濾。 使用無標籤定量（LFQ）評估樣品中蛋白質的相對豐度。

亞硫酸氫鹽處理和去甲基化序列特異性qPCR

從每位供體獲取的原代MSCs取樣，並在細胞校正當天提取基因組DNA並進行亞硫酸氫鹽處理。 按照製造商說明，使用EpiTect亞硫酸氫鹽試劑盒（Qiagen，希爾登，德國）對每個樣本的200 ng基因組DNA進行亞硫酸氫鹽處理。 處理后的亞硫酸氫鹽DNA立即用於第一輪PCR。 亞硫酸氫鹽PCR使用EpiTaq HS（寶生物工程）以1/10的亞硫酸氫鹽轉化DNA為範本進行，使用補充圖4中列出的引物，並根據製造商協定擴增40個迴圈。 使用TB Green Premix Ex Taq（寶生物工程）和補充圖S3中列出的引物進行去甲基化序列的定量。

老年MSCs的去甲基化處理

當從老年供體制備的MSCs達到70%匯合時，用1 mM DNA去甲基化誘導劑丙戊酸（VPA）[22]和5 ng/uL FGF2處理72小時。 通過檢測已知在衰老過程中受甲ylation負調控的代表性基因ELOVL2的表達變化來評估去甲基化

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處理后的基因表達變化。

統計分析

所有統計分析均使用JMP Pro 18（SAS Institute Inc.， 東京，日本）進行。 所有動物實驗和體外實驗均獨立重複三次。 對於三個或更多組之間的比較，應用Tukey的誠實顯著差異（HSD）檢驗。 對於兩個獨立組之間的比較，使用Student's t檢驗。 P值小於0.05被認為具有統計學意義。